搜索
第五章微生物的生长规律及控制微生物的特点：个体微小肉眼看到或接触到的微生物是成千上万个单个的微生物组成的群体。微生物接种是群体接种，接种后的生长是微生物群体繁殖生长。对细菌群体生长规律的了解是对其进行研究与利用的基础一、微生物的个体生长和同步生长1.微生物个体细胞的生长（1）细菌的生长一个新生的细胞长大到最后分裂为两个子细胞的过程称为细胞周期。在细胞周期内主要的细胞学变化是细胞的表面生长即细胞壁的增生、DNA的复制以及细胞分裂成子代细胞。细菌培养物在培养条件下度过的时间称为细菌的菌龄。（2）酵母菌的生长酵母菌主要的繁殖方式是出芽，酵母菌细胞的生长——芽细胞的生长。酵母菌的细胞周期是两次细胞分裂之间的时间，这个周期分为四个时期：间隔期G1、DNA合成期S、第二间隔期G2、有丝分裂期M.（3）霉菌的生长丝状真菌的生长时从孢子萌发开始的，以其菌丝顶端延长的方式进行的。当菌丝伸长到一定程度后就会出现分枝。2.微生物的同步生长目前使用的方法：（1）电子显微镜观察细胞的超薄切片设法使某一群体中的所有个体细胞尽可能都处于同样细胞生长和分裂周期中，通过分析此群体在各阶段的生物化学特性变化，来间接了解单个细胞的相应变化规律。（2）同步培养（synchronousculture）技术这种通过同步培养的手段而使细胞群体中各个体处于分裂步调一致的生长状态，称为同步生长（synchronousgrowth）。获得微生物同步生长的方法：（1）环境条件诱导法氯霉素抑制细菌蛋白质合成；细菌芽孢诱导发芽；藻类细胞的光照、黑暗控制；用EDTA或离子载体处理酵母菌；短期热休克（40℃）法等。（2）机械筛选法利用处于同一生长阶段细胞的体积、大小的相同性，用过滤法、区带密度梯度离心法或膜洗脱法收集同步生长的细胞。有效和常用的方法——Helmstetter-Cummings技术由于细胞的个体差异，同步生长往往只能维持2-3个世代，随后又逐渐转变为随机生长。二、单细胞微生物的典型生长曲线生长曲线（GrowthCurve）：定量描述液体培养基中微生物群体生长规律的实验曲线，称为生长曲线（growthcurve）。在微生物学中提到的“生长”，均指群体生长。细菌接种到定量的液体培养基中，定时取样测定细胞数量。以培养时间为横座标以菌数为纵座标作图得到的一条反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线！细菌的生长曲线一般用菌数的对数为纵坐标作图根据微生物的生长速率常数（growthrateconstant），即每小时的分裂次数（R）的不同，一般可把典型生长曲线粗分为延滞期、指数期、稳定期和衰亡期等4个时期。延滞期指数期稳定期衰亡期延滞期指数期稳定期衰亡期对于丝状生长的真菌和放线菌来说，是一条“非典型”的生长曲线，真菌的生长曲线大致可分3个时期，即生长延滞期、快速生长期、生长衰退期。又称停滞期、调整期和适应期。指少量单细胞微生物接种到新鲜培养基后，在开始培养的一段时间内细胞数目不立即增加，或增加很少，生长速度接近于零的一段时期——代谢系统是正在适应新环境。（一）延滞期（Lagphase）延滞期分裂迟缓、代谢活跃①生长速率常数为零；②细胞形态变大或增长，许多杆菌可长成丝状，Eg.巨大芽孢杆菌（Bacillusmegaterium）在延滞期末，细胞的平均长度比刚接种时长6倍；一般来说处于迟缓期的细菌细胞体积最大！1.延滞期的特点细胞处于活跃生长中，只是分裂迟缓。在此阶段后期，少数细胞开始分裂，曲线略有上升。③细胞内RNA尤其是rRNA含量增高，原生质呈嗜碱性；④合成代谢十分活跃，核糖体、酶类和ATP合成加速，易产生各种诱导酶；⑤对外界不良条件如NaCI溶液浓度、温度和抗生素等理化因素反应敏感。微生物接种到一个新的环境，暂时缺乏分解和催化有关底物的酶，或是缺乏充足的中间代谢产物等。为产生诱导酶或合成中间代谢产物，就需要一段适应期。调整代谢2.迟缓期出现的原因（1）菌种的遗传性影响延滞期长短的因素很多（2）接种龄指接种物或种子（inoculum，复数inocula）的生长年龄，亦即它处在生长曲线上哪一个阶段时用来作种子的。这里指某一群体的生理年龄。种子的接种龄子代培养物的延滞期对数期短稳定期居中延滞期或衰亡期长（3）接种量接种量的大小明显影响延滞期的长短。接种量小延滞期长接种量大延滞期短在发酵工业上，为缩短延滞期以缩短生产周期，提高发酵效率，一般采用较大的接种量。种子：发酵培养基＝1：10，V/V（4）培养基成分天然培养基营养丰富延滞期短组合培养基营养单调延滞期长发酵生产中发酵培养基种子培养基成分尽量接近（1）通过遗传学方法改变种的遗传特性使延滞期缩短；（2）利用对数生长期的细胞作为种子；（3）尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大；（4）适当扩大接种量；3.生产实践中缩短延滞期的常用手段（二）对数生长期（Logarithmicphase）又称指数生长期（Exponentialphase）。指在生长曲线中，紧接着延滞期的一段细胞数以几何级数增长的时期。指数期1.对数生长期的特点①生长速率常数R最大，因而细胞每分裂一次所需的时间——代时（generationtime，G，又称世代时间或增代时间）或原生质增加一倍所需的倍增时间（doublingtime）最短；②细胞进行平衡生长（balancedgrowth），菌体各部分的成分十分均匀；③酶系活跃，代谢旺盛；对数生长期的细菌个体形态、化学组成和生理特性等均较一致，代谢旺盛、生长迅速、代时稳定，所以是研究微生物基本代谢及遗传特性的良好材料。它也常在生产上用作种子，使微生物发酵的迟缓期缩短，提高经济效益。2.对数生长期的3个重要参数（1）繁殖代数（n）x2=x1·2nlgx2–lgx1n=————————=3.322（lgx2–lgx1）lg2（2）生长速率常数（R）n3.322（lgx2–lgx1）R=————————=————————————————t2–t1t2–t1（3）代时（G）1t2–t1G=————=————————————————R3.322（lgx2–lgx1）在细菌个体生长里，每个细菌分裂繁殖一代所需的时间为代时（Generationtime）；在群体生长里细菌数量增加一倍所需的时间称为倍增时间（Doublingtime）。影响微生物增代时间（代时）的因素①菌种，不同的微生物及微生物的不同菌株代时不同；②营养成分，在营养丰富的培养基中生长代时短，反之则长；③营养物浓度，营养物的浓度可影响微生物的生长速率和生长总量，在一定范围内，生长速率与营养物浓度呈正比；凡是处于较低浓度范围内，可影响生长速率的营养物成分，就称为生长限制因子（growyh-limitedfactor）。④培养温度，在一定范围，生长速率与培养温度呈正相关。（三）稳定期（stationaryphase）又称恒定期或最高生长期。其特点是生长速率常数R等于0，即处于新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相等，或正生长与负生长相等的动态平衡之中。稳定期这时的菌体产量达到了最高点，而且菌体产量与营养物质的消耗间呈现出一定的比例关系，这一关系就是生长产量常数Y（或称生长得率，growthyield）。x–x0x–x0Y=——————=——————C0–CC0x——稳定期时的细胞干重（g／ml培养液），x0——刚接种时的细胞干重，C0——限制性营养物的最初浓度（g／ml），C——稳定期时限制性营养物的浓度（由于计算Y时必须用限制性营养物，所以C应等于0）。进入稳定期，细胞重要的分化调节阶段，细胞内开始积聚糖原、异染颗粒和脂肪等内含物；芽孢杆菌一般在这时开始形成芽孢或建立自然感受态等；有的微生物在稳定期时还开始合成抗生素等次生代谢产物（secondarymetabolites）——稳定期产物（idiolites）。以指数期为主的菌体生长期（trophophase）以稳定期为主的代谢产物合成期（idiophase）生长期稳定期到来的原因①营养物尤其是生长限制因子的耗尽；②营养物的比例失调，例如C／N比值不合适等；③酸、醇、毒素或H2O2等有害代谢产物的累积；④pH、氧化还原势等理化条件越来越不适宜等。以生产菌体或与菌体生长相平行的代谢产物（SCP、乳酸等）为目的的某些发酵生产来说，稳定期是产物的最佳收获期；对生产实践的指导意义对维生素、碱基、氨基酸等物质进行生物测定（bioassay）来说，稳定期是最佳测定时期；通过对稳定期到来原因的研究，还促进了连续培养原理的提出和工艺、技术的创建。可延长稳定生长期，以获得更多的菌体物质或积累更多的代谢产物。生产上的措施补充营养物质（补料）取走代谢产物调节pH调节温度对好氧菌增加通气、搅拌或振荡（四）衰亡期（declinephase或deathphase）在衰亡期中，个体死亡的速度超过新生的速度，整个群体呈现负生长状态（R为负值）。衰亡期细胞形态发生多形化，例如会发生膨大或不规则的退化形态；有的微生物因蛋白水解酶活力的增强而发生自溶（autolysis）；有的微生物在这一期合成或释放对人类有益的抗生素等次生代谢产物；在芽孢杆菌中，芽孢释放等。产生衰亡期的原因外界环境对继续生长越来越不利，Eg.营养物质耗尽和有毒代谢产物的大量积累等，从而引起细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，继而导致菌体死亡。该时期死亡的细菌以对数方式增加，但在衰亡期的后期，由于部分细菌产生抗性也会使细菌死亡的速率降低，仍有部分活菌存在。不同的微生物或同一种微生物对不同物质的利用能力是不同的。有的物质可直接被利用（Eg.葡萄糖或NH4+等）——称为速效碳源（或氮源）；有的需要经过一定的适应期后才能获得利用能力（Eg.乳糖或NO3-等）——称为迟效碳源（或氮源）。当培养基中同时含有这两类碳源（或氮源）时，微生物在生长过程中会形成二次生长现象。由于采用活菌计数比较麻烦，并要求严格进行操作，否则不易得到准确的结果，重复性也差，因此在实际工作中多采用分光光度计测定OD值的方法绘制细菌的生长曲线。三、微生物的连续培养将微生物置于一定容积的培养基中，经过培养生长，最后一次收获。分批培养（batchculture）or密闭培养（closedculture）培养基一次加入，不予补充，不再更换。连续培养（Continousculture）又称开放培养（openculture），在微生物的整个培养期间，通过一定的方式使微生物能以恒定的比生长速率生长并能持续生长下去的一种培养方法。培养过程中不断的补充营养物质和以同样的速率移出培养物是实现微生物连续培养的基本原则。控制连续培养的方法恒浊连续培养不断调节流速而使细菌培养液浊度保持恒定恒化连续培养保持恒定的流速link1四、微生物的高密度培养微生物的高密度培养（highcell-densityculture，HCDC）也称高密度发酵，一般是指微生物在液体培养中细胞群体密度超过常规培养10倍以上时的生长状态或培养技术。现代高密度培养技术主要是在用基因工程菌（尤其是E.coli）生产多肽类药物的实践中逐步发展起来的。Eg.人生长激素、胰岛素、白细胞介素类和人干扰素等。提高菌体培养密度产物的比生产率（单位体积单位时间内产物的产量）减少培养容器的体积培养基的消耗“下游工程”（down-streamprocessing）中分离、提取的效率生产周期设备投入生产成本重要的实践价值高密度培养的具体方法：（1）选取最佳培养基成分和各成分含量。（2）补料，这是工程菌高密度培养的重要手段之一。（3）提高溶解氧的浓度，提高好氧菌和兼性厌氧菌培养时的溶氧量也是高密度培养的重要手段之一。（4）防止有害代谢产物的生成。下节课再见了……（一）恒浊连续培养恒浊器（turbidostat）是一种根据培养器内微生物的生长密度，并借光电控制系统来控制培养液流速，以取得菌体密度高、生长速度恒定的微生物细胞的连续培养器。测定所培养微生物的光密度值自动调节新鲜培养基流入和培养物流出培养室的流速使培养物维持在某一恒定浊度当培养室中的浊度超过预期数值时，流速加快，使浊度降低；当培养室中的浊度低于预期