生物催化

绪论1.生物催化的基本概念2.生物催化的主要内容3.生物催化的发展趋势1.1生物催化的基本概念•定义：是利用生物催化剂(主要是酶或微生物)来改变(通常是加快)化学反应速度的作用。•生物催化转化的分类：(1)发酵：用活细胞将原材料(如糖、淀粉或甲醇)转化成更复杂的目标产物。(2)前体发酵：发酵过程中添加前体物质，并由活细胞将其转化成目标产物。(3)生物转化：用酶或静息细胞经过一系列步骤，将前体转化成目标产物。(4)酶催化：提取粗酶或部分纯化的酶，将底物转化成目标产物。1.2生物催化的产生与发展远古时代：酒的酿造,饴糖的制作,豆类做酱酵母发酵的产物,是细胞内酶作用的结果用麦曲含有的淀粉酶将淀粉降解为麦芽糖在霉菌蛋白酶作用下,豆类蛋白质水解得豆酱和豆鼓,压榨后制得酱油•1878年,Kuhne第一次提出“酶”(Enzyme)的概念,意为“在酵母中”(inyeast);•1894年,EmilFischer发现了酶对底物(酶作用的物质)的专一性现象,提出了“锁和钥匙”模型;•酶晶体的获得,才认识到酶是蛋白质,是由酰胺键连接的氨基酸组成;•1926年,Sumner从刀豆中得到脲酶结晶,催化尿素水解,产生CO2和NH3.1967年,丝氨酸蛋白酶,它专门用于洗涤剂.1992年,用于生产酶的克隆技术最近发现除了“经典”酶以外，某些生物分子也具有催化活性。1982年Cech小组发现，四膜虫的rRNA(核糖体核糖核酸)前体能在完全没有蛋白质的情况下进行自我加工，催化得到成熟的rRNA产物。这就是说，RNA本身就是生物催化剂。•20世纪80年代以来，基因工程技术用于酶学研究得到高度重视。应用DNA重组技术可以生产出高效能、高质量的酶产品，用定点突变法在指定位点突变，可以改变酶的催化活性与专一性。1.3生物催化研究的重要意义•生物催化与生物转化是与生命活动及人类发展关系最为密切的自然规律之一•基于生物催化与生物转化的物质加工新模式是人类发展的必然趋势•生物催化的独特优势可以促进传统产业的升级改造•生物催化对于我国的经济发展和安全具有战略意义2.1生物催化的主要方式•生物催化几乎能应用于所有化学反应，例如氧化反应、羟基化反应、脱氢反应、还原反应、水解反应、酰基化反应等。•生物催化材料有酶、微生物菌体、动植物的组织及细胞。在手性合成中应用较多的是水解酶、氧化-还原酶以及面包酵母等微生物。•生物催化的方式有添加前体发酵法、游离酶法、静息细胞法、固定化酶法、固定化细胞法。可在水相、有机相和水-有机溶剂双相等系统中进行。2.2生物催化反应的特点•高催化效率•高专一性•酶活性受一些化合物调控酶催化能力举例底物催化剂温度(K)速度常数*脲(水解)H+脲酶3352947.4×10-75.0×1052H2O22H2O+O2Fe2+过氧化氢酶295295563.5×107*单位：(mol·L-1)-1·s-1NH3的合成•在植物中通常是25℃和中性pH下由固氮酶催化完成，酶是由两个解离的蛋白质组分组成的一个复杂的系统，其中一个含金属铁，另一个含铁和钼，反应需消耗一些ATP(三磷酸腺苷)分子；•工业上由氮和氢合成氨时，需在700-900K、10-90MPa下，还要有铁及其他微量金属氧化物作催化剂才能完全反应。酶催化的最适条件几乎都为温和的温度和非极端pH值专一性•有些酶专一性很低(键专一性),如肽酶、磷酸(酯)酶、酯酶,可以作用很多底物,只要求化学键相同,例如它们可分别作用肽、磷酸酯、羧酸酯;•具有中等程度专一性的为基团专一性,如己糖激酶可以催化很多己醛糖的磷酸化;•大多数酶呈绝对或几乎绝对的专一性,它们只催化一种底物进行快速反应.调节性•酸浓度的调节:诱导或抑制酶的合成,调节酶的降解;•抑制剂的调节:酶的活性受到大分子抑制剂或小分子抑制剂抑制,从而影响活力;•金属离子的调节:有些酶需要K+活化,但Na+不能活化这些酶,有时还有抑制作用.•生物催化剂的来源•生物催化剂改造•生物催化反应的过程工程•生物催化反应器•生物催化的应用2.3生物催化研究的主要内容生物催化研究的新进展1.生物催化一进入传统的化工领域，就给原料来源、能源消耗、经济效益、环境保护等方面带来了根本性的变化。2.作为生物技术第三次浪潮标志的生物催化技术已成为发达国家的重要科技与产业发展战略，以生物催化技术为核心的生物制造产业正以指数规律加速发展。生物技术革命性运动•第一次：1983年，美国出现第一例转基因植物；•第二次：从植物中提取诸如乙醇类的燃料，比传统石油污染更少，关系到能源生产。3.目前，美国在酶催化剂及手性化合物合成方面已处于领先地位，其生物催化制造的化学品产值已超过生物医药的产值。所以，新的生物催化剂是21世纪可持续发展的化学加工业的必需工具。到2020年通过生物催化技术，化学加工业的原料、水资源及能量消耗将各降低30％，减少污染物排放和污染扩散30％。生物催化技术的应用领域工业部门应用领域成熟程度及应用情况石油炼制生物脱硫工业示范大宗化学品乙醇/甘油已成熟/工业示范高分子聚合物可生物降解聚合物工业应用特殊有机中间体手性中间体工业应用医药医用蛋白/手性药物工业应用农用化学品生物杀虫剂工业应用日用化学品乳酸/柠檬酸接近成熟/工业应用环境保护废物处理技术开发中现状•1996年生物催化剂已占世界催化剂90亿美元市场的11%;•美国EBC成功开发了一种生物脱硫的新工艺;•我国:生物催化丙烯腈制丙烯酰胺、有机废水发酵法制氢技术、生物发酵法制造甘油已建成投产或通过中试验证.内容•酶的结构和分类•酶的分离与纯化•酶活力测定•酶作用动力学•酶的抑制作用•pH值和温度对酶作用的影响•酶的作用机制•应用酶学•酶法制备L-氨基酸•生物催化反应器•生物有机化学与生物催化蛋白质是构成人体的基础物质酶是蛋白质酶由长链氨基酸组成酶是三维结构酶结构的4个层次溶菌酶(lysozyme)的一级结构图酶的二级结构:α-螺旋和β-褶片蛋白溶菌酶的三级结构图溶菌酶部分四级结构示意图氨基酸的排序决定酶的功能酶的分类(编号的第一个数字)表示这个酶属于哪一大类.•氧化还原酶:用于将电子从一个分子转移到另一个分子;•转移酶:催化原子基团从一个分子转移到另一个分子;•水解酶:催化底物与水之间的反应,以及将水结合到某些分子上;•裂解酶:从底物上移去一个基团;•异构酶:催化原子基团从一个位置转移到另一个位置;•连接酶:利用共价键将分子连接到一起.编号的第二个数字表示在类以下的大组.•氧化还原酶：表示氧化反应供体基团的类型；•转移酶：表示被转移基团的性质；•水解酶：表示被水解键的类型；•裂解酶：表示被裂解键的类型；•异构酶：表示异构作用的类型；•连接酶：表示生成键的类型.编号的第三和第四个数字•编号的第三个数字：表示大组下面的小组，各个数字在不同类别，不同大组中都有不同的含义；•编号的第四个数字：是小组中各种酶的流水编号.1氧化还原酶的第二个数字E.C.1.醇（RR‘CHOH）1醛或酮(RR’C=O)2RR’CHCHRR‘3伯胺RCHNH24仲胺RR’CHNH—5NADH或NADPH6氢或电子供体氧化还原酶的第三个数字氢或电子受体E.C.1.1~6.NAD+或NADP+1Fe3+(如细胞色素)2O23其他未分类的受体99NAD+(NADP+):烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(磷酸)举例:L-乳酸+NAD+氧化还原酶CH3CH(OH)COO-NAD+E.C.1.1.1.27CH3COCOO-+NADH+H+注意：氧化反应发生在醇基而不是羧基.2转移酶的第二个数字转移的基团含一个碳原子的基团1醛基或酮基2酰基3糖基4含磷基团7E.C.2.2转移酶的第三个数字,例如:E.C.2.1.1E.C.2.1.2E.C.2.1.3E.C.2.4.1E.C.2.4.4转移甲基的酶类转移羟甲基的酶类转移羧基的酶类转移己糖基的酶类转移戊糖基的酶类3水解酶的第二个数字水解的键酯键1糖苷键2肽键4肽键以外的C-N键5E.C.3.3水解酶的第三个数字,例如:E.C.3.1.1E.C.3.1.2E.C.3.1.3E.C.3.1.4水解羧酸酯的酶类水解硫代酯的酶类水解磷酸单酯的酶类水解磷酸二酯的酶类4裂解酶的第二个数字裂解的键C—C1C—O2C—N3C—S4E.C.4.4裂解酶的第三个数字以C—C裂解酶为例移去基团E.C.4.1.1羧基(即CO2)E.C.4.1.2醛基(CH=O)E.C.4.1.3酮羧基(-OOC-C=O)5异构酶的第二个数字反应类型消旋和差向异构1顺式-反式异构2分子内氧化还原酶类3分子内的转移反应4E.C.5.5异构酶的第三个数字,例如:底物E.C.5.1.1氨基羧E.C.5.1.2羟基羧酸E.C.5.1.3糖类6连接酶的第二个数字合成的键C—O1C—S2C—N3C—C4E.C.6.6连接酶的第三个数字,例如:进一步说明合成的键E.C.6.3.1E.C.6.3.2羧酸-氨(胺)连接酶类酰胺合成酶类羧酸-氨基酸连接酶类肽合成酶类酶的纯化独有的特点•特定的一种酶在细胞中的含量很少；给纯化带来了困难•酶可以通过测定活力的方法加以跟踪。能迅速找出纯化过程的关键所在酶的纯化过程包括下列步骤•建立一个适当的测活方法•酶源选材要以含酶丰富、取材方便、经济为原则•酶的提取•酶的提纯•酶的纯度检验细胞中的磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧基酶能催化下列反应：PEP+CO2+GDPOAA+GTP在细胞中还存在好几种以PEP为底物的酶：PEP羧化酶：PEP+HCO3-→OAA+Pi丙酮酸激酶：PEP+ADP→丙酮酸+ATPPEP羧基转磷酸化酶：PEP+CO2+Pi→OAA+Pi测定酶活力方法要求•高灵敏性、高准确性•是否经济•方法简单一个好的测活方法的建立，就是整个纯化工作成功的一半。•例如，在分离纯化动物Cu、Zn-SOD（超氧化物歧化酶）时，一般以动物血球为原料；•Mn-SOD主要存在于线粒体中，所以肝、肾脏适宜作原材料；•利用动植物细胞体外大规模培养技术，可获得极为珍贵的原材料（如人参细胞、某些昆虫细胞等），用于酶的分离纯化；•利用基因工程重组DNA技术，使某些在细胞中含量极微的酶的纯化成为可能。酶的提取除在体液中提取酶或胞外酶外，一般是将含目的酶的生物组织破碎，促使酶增溶溶解，最大程度的提高抽提液中酶的浓度。酶的提取方法•生物组织的破碎•抽提机械法超声波法冻融法渗透压法酶消化法超声波法•细菌和酵母细胞能得到很好的破碎；•问题：超声空穴局部过热引起酶活性丧失，所以时间应尽可能短，容器周围以冰浴处理。冻融法•生物组织经冰冻后，细胞胞液结成冰晶，使细胞壁胀破；•简单易行，但效率不高，需反复几次才能达到破壁效果；•若冻融时间过长，还应注意胞内蛋白酶作用引起的后果，一般需在冻融液中加入络合剂EDTA等蛋白酶抑制剂以防破坏目的酶。渗透压法•是破碎细胞最温和的方法之一，细胞在低渗溶液中溶胀破碎；•此法对具有坚韧的多糖细胞壁的细胞，如植物、细菌和霉菌不太适用。酶消化法•利用溶菌酶、蛋白水解酶、糖苷酶对细胞膜或细胞壁的酶解作用，使细胞崩解破碎；•酶消化法常与其他破碎方法联合使用，如在大肠杆菌冻融液中加入溶菌酶就可大大提高破碎效果。抽提破碎生物组织一般在适当的缓冲溶液中进行。典型的抽提液由以下几部分组成：抽提液=离子强度调节剂+pH缓冲剂+温度效应剂＋蛋白酶抑制剂＋防氧化剂＋重金属络合剂＋增溶剂常用的提纯方法性质方法溶解度改变离子强度、改变pH、温度、改变介电常数电荷极性离子交换层析、色谱聚焦、电泳、等电聚焦大小或重量离心分离、透析超滤、凝胶过滤亲和部位亲和层析、免疫吸附层析、共价层析酶纯化的目标是使酶制剂具有最大的催化活性和最高纯度，以下几种方法用于检验这些指标：1.酶纯度的检验2.酶催化活性的检验3.酶活性部位滴定酶活力测定•在酶作用下化学反应进行的速度，就代表酶的活力；•酶活力的测定，实质上就是一个测定为酶所催化的反应速度问题。不同时间的反应速度和酶量关系由上图可以看出，只有在反应的初速度阶段，反应速度才正比于酶量，因此只有用初速度表示酶活力才能准确地代表酶制剂中酶的含量。在实际测定过程中，