酶的分离与纯化

酶的分离与纯化分析1.酶分离纯化的一般原则2.酶纯化的基本步骤3.酶纯化的常用方法酶的纯化过程•1、建立一个适当的测活方法•2、酶源选材要以含酶丰富、取材方便、经济为原则•3、酶的提取•4、酶的提纯•5、酶的纯度检验一、酶的提取•1、生物组织的破碎•（1）机械（匀浆）法•（2）超声波法•（3）冻融法•（4）渗透压法•（5）酶消化法2、抽提•典型的抽提液由以下几部分组成：•抽提液=离子强度调节剂+pH缓冲剂+温度效应剂•(KCl、NaCl、蔗糖)(各种缓冲液)（甘油、二甲基亚砜）•+蛋白酶抑制剂+防氧化剂+重金属络合剂+增溶剂•（PMSF、DIFP）(DTT、巯基乙醇)EDTA、柠檬酸(TritonX-100)•通常都用0.3mol/L的蔗糖溶液或0.15mol/LKCl溶液抽提。3蛋白質抽取●如何開始？5W基本原則●材料來源：材料取得與保存●均質及抽取：確實做好第一步●鹽析及沉澱法：最經濟方便方法二、酶的提纯•酶的提纯手段一般都是依据酶的分子大小、形状、电荷性质、溶解度、专一结合位点等性质而建立的。要得到纯酶，往往需要将各种方法联合使用。常用的提纯方法性质方法溶解度改变离子强度改变pH、温度改变介电常数电荷极性离子交换层析色谱聚焦电泳等电聚焦大小或重量离心分离透析超滤凝胶过滤亲和部位亲和层析染料配体亲和层析免疫吸附层析共价层析酵素的純化過程可分為三個階段：•(1)粗蛋白質(crudeprotein)︰採樣→均質打破細胞→抽出全蛋白，多使用鹽析沉澱法；可以粗略去除蛋白質以外的物質。•(2)部分純化(partiallypurified)︰初步的純化，使用各種管柱層析法。•(3)均質酵素(homogeneous)︰目標酵素的進一步精製純化，可用製備式電泳或HPLC。酶的纯化及分析方法•鹽析沉澱法可分離出樣本中的蛋白質。蛋白質在水溶液中的溶解度，會因溶液中其它鹽類濃度的改變而增減，可利用來沉澱蛋白質。其原理是因於蛋白質分子表面電荷的改變，或者分子上極性或非極性區域與水分子間作用結果。■盐浓度對蛋白質溶解度的影響：●鹽溶Salting-in:加鹽使蛋白質溶入水溶液中●鹽析Salting-out:加鹽使蛋白質由水溶液中沉澱出來設計純化步驟時，需考慮下列各項要求•a.高活性•b.高回收率•c.高純度•d.方便與快速組合純化步驟•a.組合標準•(1)已知的酵素，可依照已發表的步驟進行，有問題再作改進。通常都是以硫酸銨分劃-膠体過濾-離子交換為骨幹，再加上其它方法，組成全部流程。•(2)對完全未知的酵素，可循此骨幹先試行純化，看其結果如何再加改進。•(3)不要忘記利用該酵素的特殊性質來純化，如在其pI沉澱性、特別的疏水性、有專一的抑制劑或熱穩定性等。近朱者赤、近墨者黑，物以類聚，不論人類或是分子皆同色谱的类型.常用的層析方法膠體過濾法•膠体過濾属partition層析法，流動相為溶離緩衝液，固定相為膠体孔隙內的緩衝液。溶質(樣本蛋白質)根據其分子量的大小，決定分佈在這兩相的比例。分子量大的不易進入膠球，隨流動相溶離；分子量小的，則易竄入膠球內的固定相，而被延滯流出膠柱。分子的形狀、大小均為影響因素，即與其分子半徑(Stokesradius)有關，與分子量不完全成正比關係；但一般均視蛋白質為球形，故其形狀較無影響力。•膠体過濾法在操作時，有些內在的問題，會影響結果的好壞：•(1)擴散及亂流：由於是在液相中進行，樣本在膠柱中的擴散現象相當顯著；又因液体在膠球間流動時，受重力及對流的影響，會造成亂流。擴散及亂流都會使膠体過濾的解析力降低甚多。•(2)管柱設計不良：經常是致命的傷害，例如無效空間(deadvolume)過大、緩衝液進入膠体時流動不均、溶離液出口端的管路太長或太粗等。管柱操作单击显示管柱操作的详细步骤離子交換法•離子交換法乃利用分子的帶電性質進行分離，解析力好且具多樣性，是重要而應用極廣的純化方法。•原理概述•a.離子交換法•是一種adsorption層析法，流動相為溶離緩衝液，固定相為介質擔体表面的帶電基團。樣本中各種離子，與介質表面帶電基團間的親和力強弱不同，吸附上去之後，可使用不同離子濃度的緩衝液，分別溶離出這些成分EnvironmentalpH76891054311+-0NetChargeofaProteinIsoelectricpoint,pI■環境影響分子的帶電性質b.兩大類離子交換介質•由介質帶電基團的不同，可分為兩大類：•介質-帶電基團(counterion)•(1)陽離子交換介質(cationexchanger)：•擔体-陰離子基團.....陽離子•(2)陰離子交換介質(anionexchanger)：•擔体-陽離子基團.....陰離子色層焦集法•樣本蛋白質進入色層焦集管柱後，先遇到較高pH環境(介質)，通常高於其pI而帶負電，因此會結合到介質上。當Polybuffer開始注入管柱，降低環境pH，使樣本分子失去負電荷而溶離下來；蛋白質便依pI大小順序，pI高的先溶離出來；同時會集中在其pI的地方，成為一條極細色帶，故稱為焦集法。■專一性結合力量的構成因素：+KI.ConformationalMatch:VanderwaalsinteractionII.InteractionForces:(1)Hydrogenbond(2)Hydrophobicinteraction(3)Electrostaticinteraction(4)Vanderwaalsinteraction■典型的親和層析操作：pH2.05ProteinElutionVolume*Activity■以親和層析法純化Trypsin：ABCDSDSDiscABC&D以膠體電泳檢定親和層析操作過程各步驟的樣本→ChitinCHOMTrypsinHPLC與FPLC•HPLC為高效能液相層析法(highperformanceliquidchromatography)之意；也有說是highpressure，因為要使用高壓推動溶離液，以加速層析過程。FPLC則不用高壓，但流洗速度也很快(fastperformance)，是因為所用的介質通透性極高之故。用於adsorption型式的層析法，例如以離子交換分離各種胺基酸等小分子。近來由於介質材料的發展，各種應用在大分子的液相層析法，均可HPLC的方式來進行；不但加快分析速度，也使解析度提高很多。除了上述的離子交換法外，還可用在膠体過濾法、逆相層析法或親和層析法；HPLC及FPLC系統，將來有可能取代傳統的低壓慢速液相層析法。三总结•单击显示酶分离、纯化及分析实验分步指导