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1生物选修3知识点（区别不同工程和不同操作水平）专题1基因工程概念：按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基本原理：让目的基因在受体细胞内稳定且高效的表达理论基础：DNA是生物遗传物质的发现，DNA双螺旋结构，遗传信息传递方式核心：构建重组DNA分子（一）基本工具（技术基础）Cf工具&工具酶1.限制性核酸内切酶（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的（不切割自身DNA的原因：原核生物中无该限制酶的识别序列或其已被修饰）（2）功能：识别和切割DNA分子内一小段特殊的脱氧核苷酸序列（偶数碱基对回文序列）特异性表现：识别特定片段、切割该片段中的特定位点、形成一种末端Cf—G↓GATCC—&—↓GATC—（3）结果：DNA片段末端形成末端碱基互补的黏性末端或平末端①用切割（质粒）②根据目的基因的位置或剪辑序列来确定限制酶的种类③切割后的片段要画全2.DNA连接酶（1）功能：连接具有末端碱基互补的2个DNA片段，形成重组DNA分子CfDNA聚合酶：只能将单个脱氧核苷酸逐个添加到已有的脱氧核苷酸链之后，需模板DNA，连接磷酸二酯键3.载体（1）条件：①能在受体细胞中稳定保存并大量复制，基本不影响受体细胞正常生命活动②一至多个限制酶酶切位点（必须在所需标记基因外），供外源DNA片段插入③标记基因，便于筛选含有重组DNA分子的受体细胞——往往需要根据需求改造天然载体（2）功能：①作为运载工具将目的基因转移到受体细胞内——载体选质粒的原因：具有环状结构，能够携带目的基因②利用它在受体细胞内对目的基因进行大量复制和转录/表达（3）质粒（最常用的载体）一种能够自主复制，在细菌(或酵母菌)中独立于染色体之外存在的双链环状DNA分子（4）其它载体：噬菌体、动植物病毒(二)基因工程的基本操作程序第一步：获取目的基因1.目的基因：人们所需要的编码蛋白质的结构基因2.方法(1)序列已知①化学合成法——较长DNA单链合成过程中容易出现碱基缺失如反转录法（e.g获取mRNA逆转录成cDNA再用DNA聚合酶生成双链）②聚合酶链式反应(PCR)扩增PolymeraseChainReaction2（1）原料：水、缓冲液、4种游离脱氧核苷酸、TaqDNA聚合酶、模板DNA(……基因)、对…基因特异的2段DNA引物（防止相互或自身折叠）（2）过程：第一步：加热至90～95℃，DNA在高温下变性解链第二步：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链（退火）第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成能量来源于dNTP(2)序列未知建立基因文库：建立一个包括目的基因在内的基因文库(保存在受体菌中)，再从基因文库中获取3.目的基因大量扩增/分子水平的克隆①利用受体细胞（如E.coli）无性繁殖，利用基因探针钓取，再导入最终受体细胞e.g目的基因→大肠杆菌→农杆菌→植物细胞→植物（主要在细菌分裂时几何级扩增，尽管质粒独立于拟核，可在分裂时发生自我复制，但由于多数细菌对胞内质粒数量有限制，故该种复制对扩增效果不大）②PCR技术第二步：形成重组DNA分子（基因表达载体：启动子＋目的基因＋终止子＋标记基因）1.目的：转运目的基因，并使在受体内稳定存在、复制、表达/转录并稳定遗传（基因型X0）2.过程：（1）单酶切：用同种限制酶分别切割目的基因和载体从而形成相同的粘性末端，然后用DNA连接酶将目的基因和载体连接起来——有时用不同限制酶也可以形成相同的粘性末端（2）双酶切：用两种限制酶切割使目的基因和载体两端各形成两种粘性末端，防止载体和目的基因自身环化第三步：将重组DNA分子导入受体细胞——需将目的基因整合到动植物细胞的染色体DNA上目的基因是否整合到染色体DNA上决定于基因表达载体上是否有相关序列（形成酶）1.植物体细胞：农杆菌转化法（插入Ti质粒上的T-DNA），基因枪法、花粉管通道法——导入叶绿体DNA中，由于细胞质/器DNA的遗传与性别相关联，故可避免因花粉传播而造成基因污染（目的基因传播到非转基因生物中）2.动物受精卵：显微注射技术用（如显微注射）技术/方法将目的基因导入cf转基因/基因工程技术3.原核细胞：CaCl2/Ca2+处理法（先用Ca2+处理增加细胞壁通透性，使之成为感受态细胞，再将重组质粒与感受态细胞混合，在一定温度下感受态细胞吸收DNA分子）——原核生物作为受体细胞的原因：①繁殖快②体积小新陈代谢旺盛（目的产物合成效率高）③遗传物质少（便于操作）、④单细胞（容易培养）第四步：筛选含有目的基因的受体细胞1.原因：受体细胞接纳重组DNA分子存在概率2.原理：载体如质粒上的抗性基因等标记基因3.方法：利用选择培养基筛选①蔗糖转运蛋白：仅以蔗糖作为碳源的培养基②菌落表现型：抗……不抗……第五步：目的基因的检测和表达——目的基因导入受体细胞可能仅进行大量扩增，但不一定以此为目的1.DNA/核酸分子杂交技术3用cDNA作为探针与从受体细胞中提取并解旋的DNA/mRNA杂交，观察是否会出现杂交带检测①染色体DNA上是否插入了目的基因②目的基因是否转录出了mRNA——①一种基因探针只能检测水体中的一种病毒；检测病毒可对照核酸序列②放射性同位素标记探针③基因探针是一小段cDNA，可以与相应基因转录出的mRNA结合（即使被切割）采用DNA分子杂交技术/方法，用基因探针检测2.抗原－抗体杂交：目的基因是否翻译成蛋白质如E.coli合成人胰岛素原3.个体水平的鉴定：如转基因抗虫植物（让害虫吞食该转基因棉植株的叶片，观察害虫存活情况，以确定其是否具有抗虫形状）——根本原因：联系基因层面，cf基因序列&碱基对/脱氧核苷酸序列（三）基因工程的应用1.动植物基因、细胞工程：优点①所需时间短②克服远缘杂交不亲和的缺陷（对应传统缺点）2.基因工程药物：首次是生长素释放抑制激素，然后胰岛素（E.coli产酶原）、干扰素等干扰素：我国第一个基因重组新药。一组具有多种功能的活性蛋白质（主要是糖蛋白），是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。具有抗病毒、抗细胞分裂、免疫调节等多种生物学功能，是治疗病毒性肝炎和肿瘤的药物。干扰素是一种广谱抗病毒剂，并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制乙肝病毒的复制；同时还可增强自然杀伤细胞（NK细胞）、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。3.基因治疗：将正常功能的外源基因导入缺陷细胞内（初级实验阶段、未临床实践）——Cf有基因缺陷的染色体/DNA分子上：具体与哪条DNA分子结合随机——治疗隐性遗传病（正常基因相对缺陷基因呈显性）4.安全性问题：在导入目的基因的同时可能会导入其他基因如抗生素抗性基因，可能会使人体内细菌抗药性增强，以致某些药物的药效减弱（四）蛋白质工程的概念蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。（基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质）转录翻译专题2细胞工程（一）克隆1.克隆clone：无性繁殖系（只由一个模板分子、母细胞或母体直接形成新一代…）2.克隆技术cloning：从众多基因或细胞群体中通过无性繁殖和选择获得目的基因或特定类型细胞的操作技术3.内容：（1）分子水平：基因克隆即目的基因的复制（受体细胞的无性繁殖）、分离（特定基因探针选择、钓取目的基因）过程4（2）细胞水平：杂交瘤制备单克隆抗体（3）个体水平：不通过两性细胞的结合，从一个单一（体）细胞繁殖出生物个体——胚胎细胞克隆以胚胎/卵细胞作为供体、利用核移植，不是严格意义上的动物个体克隆4.条件：（1）理论条件：细胞全能性/细胞有发育成完整个体的全套遗传物质（根本原因）（2）基本条件：①具有包含物种完整基因组的细胞核的活细胞②具有能有效调控细胞核发育的细胞质物质e.g去核卵细胞③完成胚胎发育的必要的环境条件e.g胚胎早期培养环境/子宫5.非正面影响：丰富生物多样性，促进生物进化，维护生态平衡（二）植物克隆1.全能性表达的难易程度：受精卵＞生殖细胞＞胚胎/全能干细胞＞多能（干）细胞＞专能（干）细胞＞体细胞；——生殖细胞在一定刺激下染色体可加倍；一些动物存在孤雌生殖植物细胞＞动物细胞；低等动物＞高等动物——不同种类植物或同种植物的不同基因型个体间全能性的表达程度大不相同长期培养后的全能性下降原因：染色体畸变、核变异、非整倍体产生；细胞或组织中激素平衡被打破；细胞对外源生长物质的敏感性改变；形成缺乏成胚性的细胞系——植株在多次继代培养后，会逐渐丧失细胞全能性的表达能力2.植物组织培养（植物克隆的技术基础）（1）理论基础：植物细胞全能性，即植物体的每个生活细胞都具有遗传上的全能性，因而都具有发育成完整植株的潜能（2）过程：①离体植物细胞、组织或器官（外植体）→获得愈伤组织→诱导形成试管苗→新植株——外植体选取形成层(分生组织)部分易于诱导形成愈伤组织A.培养条件：首先是离体培养(生物体内细胞中基因在特定时间和空间条件下选择性表达，细胞分化为不同组织、器官，故无法表现出全能性)半/固体培养基（固体为例）a.营养物质：水、无机盐、蔗糖、维生素、有机添加剂(氨基酸、琼脂凝固剂等)b.植物激素/生长调节剂（适当浓度配比诱导分化出芽/根的顶端分生组织/花）——IAACTK诱导外植体脱分化形成愈伤组织c.无菌条件（外植体70%酒精消毒、器械高温蒸汽灭菌）——杂菌争夺产毒d.适宜的pH、温度和渗透压B.光照：若外植体是（带叶）茎段，不经历脱分化再分化，组培全过程均需要光照；若外植体是非光合作用部位（如胡萝卜块根），再分化成芽后光照C.试管苗移栽前需炼苗（草炭土/蛭石，逐渐降湿）D.愈伤组织：排列疏松的高度液泡化的活的薄壁组织团②外植体→愈伤组织→摇床液体悬浮培养分散成单细胞→胚状体→人工种子——单细胞植物克隆，类似受精卵的卵裂、分化、器官发生、形态建成A.单细胞：细胞质丰富、液泡小、细胞核大（胚性细胞特征）③酶解细胞壁→原生质体培养→新植株（2）用途：微型繁殖、制造人工种子(胚状体阶段)、单倍体育种、作物脱毒（植物分生组织细胞，分裂旺盛病毒极少Cf抗病毒）、在培养基中加入不同浓度的氯化钠溶液，可诱发和筛选抗盐植株细胞产物工厂化生产（愈伤组织阶段已可，试管培养苗、细胞培养反应器也可）3.原生质体融合/植物体细胞杂交（不同植物）获得原生质体：在甘露醇溶液环境（较高渗透压）中用纤维素酶和果胶酶混合液处理用网筛过滤原生质体到离心管内，离心后收集沉淀物，用等渗溶液洗涤；检验原生质体是否符合要求：依据渗透作用原理，采用低渗胀破法5（见比较表格）4.植物细胞工程：培养植物细胞（包括原生质体），借用基因工程技术将外源DNA导入受体细胞或通过细胞融合将不同源的遗传物质重新组合，再通过细胞培养，获得具有特定性状的植株Cf细胞工程：细胞培养和细胞融合（若基因型不同为细胞杂交）——基因定位：利用细胞杂交中染色体丢失与特定基因产物的对应关系（三）动物细胞工程1.动物细胞培养指明“动物”细胞培养（1）概念：动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和繁殖。原理：细胞增殖（2）动物细胞培养：①取动物组织块（动物胚胎或幼龄动物的器官或组织）②机械消化或用胰蛋白酶处理分散成单个细胞（利于细胞与培养液充分接触，进而吸收氧气和营养物质并排出废物）③制成细胞悬液→转入细胞培养瓶/卡式瓶中进行原代培养——细胞间相互依存，呈现一定程度的组织特性，保持生长分裂、接触抑制、衰老死亡④贴满瓶壁的细胞用胰蛋白酶处理使贴壁细胞从瓶壁上脱落下来并分散成单个细胞稀释分装传代培养（最初的若干次传代也归入原代培养）——大多数细胞最终衰老、凋亡（①营养物质耗尽②遗传物质没变，衰老凋亡）动物组织培养：动物组织在体外及人工条件下维持生活状态或生长特性——可伴随组织分化，但主要的生命活动