分子生物学常用技术原理.

１Geneticengineering重组DNA技术的发展史1865年G.J.Mendel的豌豆杂交试验1944年O.T.Avery的肺炎球菌转化实验1973年美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子1977年美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。1980年开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂1997年英国罗林研究所成功的克隆了多莉分子生物学常用技术原理•相关概念DNA克隆工具酶目的基因基因载体•基本原理•重组DNA技术应用本节主要内容一、基因工程的基本概念克隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。技术水平：分子克隆(molecularclone)即DNA克隆细胞克隆个体克隆（动物或植物）生物技术工程:基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等目的①分离获得某一感兴趣的基因或DNA②获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）基因工程(geneticengineering)——利用基因克隆方法获取目的基因并使克隆的基因表达为蛋白质或多肽产物或定向改造细胞乃至生物个体的特征及相关的工作称基因工程，二、工具酶•限制性核酸内切酶•DNA聚合酶Ⅰ•逆转录酶•T4DNA连接酶•碱性磷酸酶•末端转移酶•TaqDNA聚合酶•多核甘酸激酶等重组DNA技术中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶Ⅰ①合成双链cDNA分子或片段连接②缺口平移制作高比活探针③DNA序列分析④填补3´末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA3末端标记等反转录酶①合成cDNA②替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3´羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基（一）限制性核酸内切酶1、概念限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)是识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。HindⅢ属系株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶2、限制性核酸内切酶命名Ⅱ类酶识别序列特点——回文结构(palindrome)切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG3、限制性核酸内切酶的识别和切割位点分为I,和II类限制性内切酶.重组DNA主要用II类酶BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口（1）、产生5突出粘性末端，以EcoRI为例5GAATTC..33CTTAAG..55…GAATTC….33…CTTAAG…5(2)、产生3突出粘性末端，以Pst为例5’…CTGCAG3’…3’GACGTC…5’5’…CTGCAG…3’3’…GACGTC…5’(3)、产生平端：如前图作用与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。*分类Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）（二）、其它工具酶1、DNA连接酶2、DNA聚合酶、（1）、DNA聚合酶的性质；（2）、DNA聚合酶的主要用途3、逆转录酶4、多核苷酸激酶5、硷性磷酸酶6、末端脱氧核苷酸转移酶三、载体定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。常用载体质粒DNA噬菌体DNA病毒DNA粘粒DNA克隆载体(cloningvector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expressionvector)为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。三、载体此处是标题wanghome表达载体载体的选择标准•能自主复制；•具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；•有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；•分子量小，以容纳较大的外源DNA。（一）、质粒(plasmid)特点:能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。λ噬菌体DNA改造系统λgt系列（插入型，适用cDNA克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）（二）.噬菌体(phage)M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列（三）粘性质粒(cosmid)其它：如酵母人工染色体(yeastartificialchromosome,YAC)细菌人工染色体(bacterialartificialchromosome,BAC)（四）、病毒用动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）重组DNA(recombinantDNA)-分子克隆应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或DNA克隆)。四、重组DNA技术的基本原理基本原理目的基因的获取DNA导入受体菌外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建重组体的筛选克隆基因的表达以质粒为载体的DNA克隆过程目录五、重组DNA技术的基本过程（一）目的基因的制备1.化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。2.基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)3.cDNA文库(cDNAlibrary)4.聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)*化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合*从基因组DNA文库获取目的基因限制酶切位点限制酶消化除去中间片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色体DNA限制酶部分消化外源DNA与载体DNA混合连接反应体外包装用重组噬菌体感染大肠杆菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文库目录mRNAcDNA双链cDNA重组DNA分子cDNA文库反转录酶载体受体菌复制*从cDNA文库获取目的基因逆转录酶AAAATTTTAAAASI核酸酶DNA聚合酶Ⅰ碱水解TTTT目录（二）目的基因与载体的连接1.粘性末端连接方式：(1)同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接BamHⅠ切割反应GGATCCCCTAGGT4DNA连接酶15ºCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG载体DNA用BamHⅠ切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG重组体GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG载体自连目的基因自连同一限制酶切位点连接目录不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接GAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGAEcoRⅠ切割位点GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTABglⅡ切割位点AATTCGATCTAGAATTCGGATCTAAATTCGATCTAG+EcoRⅠ+BglⅡ双酶切EcoRⅠ+BglⅡ双酶切GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAT4DNA连接酶15ºC重组体配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。目录2.同聚物加尾连接在末端转移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。3.平端连接适用于：限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶15ºC重组体载体自连目的基因自连目录5´3´3´5´载体DNA5´3´3´5´目的基因限制酶或机械剪切限制酶5´3´3´5´5´3´T(T)nTT(T)nT3´5´5´3´3´5´5´3´A(A)nAA(A)nA3´5´λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端转移酶+dATP末端转移酶+dTTPT4DNA连接酶15ºC重组体目录4.人工接头(linker)连接由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。人工接头及其应用CCGAATTCGGGCTTAAGC5´-3´-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ受体菌条件安全宿主菌限制酶和重组酶缺陷处于感受态(competent)导入方式转化(transformation)转染(transfection)感染(infection)（三）重组DNA导入受体菌（四）重组体的筛选和鉴定1.直接选择法(1)抗药性标记选择（遗传学方法）(2)标志补救(markerrescue)(3)分子杂交法原位杂交Southern印迹2.免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等3.基因重组与表达技术基因来源:酶切片段mRNAcDNA(RT-PCR)PCR产物化学合成：单链寡核苷酸互补寡核苷酸链退火时,注意温度变化要非常的缓慢,有利于寡核苷链完全正确互补成双链(95℃自然冷却至室温)克隆重组克隆载体的选择抗生素双抗性载体：pBR322(amp+,tet+)互补筛选:pUC19pBluecriptII基因与载体的连接外源片段与载体的比例：平端(3-10):1，粘端1:1转化宿主:JM109DH5TG1(competentcell)重组子的筛选与鉴定抗药性标志的选择pBR322AmpTet插入片段Amp平板Tet平板重组子的筛选与鉴定（ß-半乳糖苷酶）lacZAmN2HN片段COOHC片段宿主菌重组子的筛选与鉴定－蓝白筛选原理X-galLacZ蓝色化合物重组子原理（LacZ基因N端序列）插入片段（LacZ基因失活）LacZ基因N端序列LacZ酶蓝白斑筛选α互补：laz’编码的α肽链；β半乳糖苷酶突变体α-互补（α-complementation）：在T-vector或PUC质粒序列中，插入了lac启动子-操纵子基因序列以及编码β-半乳糖苷酶N-端145个氨基酸的核苷酸序列（又称α-肽）；这类载体对应的宿主菌（如JM、DH5α系列）β-半乳糖苷酶基因失去了编码α-肽碱基序列只有当这类载体引入到宿主菌后，载体上的β-半乳糖苷酶N-端片端才能与宿主菌的缺陷β-半乳糖苷酶互补，产生有活性的β-半乳糖苷酶，这种作用称为α-互补。重组子鉴定挑分离良好，大小中等的菌落培养5ml菌液小量制备质粒酶切，琼脂糖凝胶电泳测序基因表达•选择表达系统•原核系统真核酵母动物细胞植物细胞构建表达载体重组克隆载体表达载体目的基因亚克隆正确的ORF导入细胞:化学方法（CaCl2)、电转化、显微注射、基因枪外源基因表达:化学诱导、温度诱导基因表达检测:SDS-PAGE、RT-PCR、WesternBlot亚克隆一、定义将克隆DNA片段从一个载体转移到另一个载体二、应用研究克隆DNA片段其中的一段序列克隆DNA片段的表达(插入失活法)抗药性标记选择目录组氨酸缺陷型大肠杆菌无组氨酸的培养基酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因促进组氨酸合成λDNA重组体标志补救α互补目录α互补的检测目录原位杂交目录Southern