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第二节基因工程的原理和技术要想将某个特定基因与质粒相连，需要用几种限制性核酸内切酶？思考题：TGCAACGTACGTGCATACGTGCAG标记基因ACGTGCAT外源基因ACGTGCAT重组质粒或重组DNA传统的生产胰岛素的方法只能从猪和羊的胰腺中提取,获得1g胰岛素大约需要100Kg的猪胰脏糖尿病治疗1978年,科学家在大肠杆菌中成功表达了人胰岛素,并于1982年被美国批准上市基因工程的基本原理让人们感兴趣的基因（目的基因）在宿主细胞中稳定和高效表达。基因工程的基本操作程序1、获得目的基因2、形成重组DNA分子3、将重组DNA分子导入受体细胞4、筛选含有目的基因的受体细胞5、目的基因的表达剪切拼接导入筛选表达目前被较广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素基因、种子贮藏蛋白基因、植物抗病基因等。基因操作的基本步骤一、提取目的基因——将需要的基因从供体生物的细胞内提取出来。供体生物细胞取出DNA用限制酶剪去多余部分目的基因限制酶目的基因的序列未知1、从基因文库中获取目的基因的序列已知2、利用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增3、人工合成获取目的基因的常用方法：1、基因文库的构建——直接分离法（或鸟枪法）该法最大的缺点是带有很大的盲目性，工作量大，成功率低。且不能将真核生物的基因转移到原核生物中去。2、利用PCR技术扩增目的基因聚合酶链式反应，在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。可以获得大量的目的基因。PCR扩增仪氢键断裂，形成单链DNA。引物与DNA模板结合，形成局部双链。在酶的作用下，不断延伸，合成双链DNA。多次循环，获得大量双链DNA分子。PCR技术扩增目的基因的mRNA逆转录单链DNA合成双链DNA（目的基因）蛋白质氨基酸序列推测mRNA的核苷酸序列推测结构基因的核苷酸序列化学合成目的基因人工合成法•逆转录法•根据已知氨基酸序列直接合成DNA二、形成重组DNA分子——核心质粒DNA分子限制酶处理两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种一个切口两个黏性末端目的基因与质粒的连接三、将重组DNA分子导入受体细胞（1）常用的受体细胞：有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。探究：转基因过程中，怎样选择受体细胞？转基因植物——转基因动物——转基因微生物——植物体细胞或受精卵受精卵大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌等探究：为什么常用微生物作为受体细胞？目的基因导入受体细胞后，就可以随着受体细胞的繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时间内就能够获得大量的目的基因。微生物可通过发酵大量繁殖。（2）将目的基因导入微生物细胞受体细胞：细菌氯化钙细胞壁的通透性增大重组质粒进入受体细胞目的基因随受体细胞的繁殖而复制将目的基因导入植物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。将目的基因导入动物细胞显微注射技术提纯基因表达载体体外显微注射入受精卵受精卵移植1.将目的基因导入植物细胞农杆菌转化法基因枪法2.将目的基因导入动物细胞显微注射技术（最多、最有效）3.将目的基因导入微生物细胞Ca2+处理，以增加细菌细胞壁的通透性。探究：如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？1）原理：2）方法：3）举例所有受体细胞接种含有四环素的培养基筛选生活的受体细胞导入重组DNA分子（抗四环素基因）培养含重组DNA分子的受体细胞四、筛选有目的基因的受体细胞质粒上有抗生素的抗性基因利用选择培养基筛选筛选含有目的基因的受体细胞前三步的处理十分繁锁，为保证目的基因得到有效利用，通常用大量的受体细胞来接受不多的目的基因。这样，处理的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少，必须将它从中检测出来。无表达产物无表达产物有表达产物无表达产物细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。多细胞生物的检测，将每个受体细胞单独培养并诱导发育成完整个体，检测这些个体是否摄入目的基因，摄入的基因是否表达（是否表现出相应的性状）。淘汰无变化的个体，保留有相应变化的个体进一步培养、研究。例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。•受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因一定能完成表达吗？含有目的基因的受体细胞不一定都能表达。(五)目的基因的表达看到目的性状或分离到目的基因表达产物•外源基因在受体细胞内表达的理论基础基因是控制生物性状的基本单位生物界共用一套遗传密码遗传信息的传递都遵循中心法则的信息流动方向人胰岛素原基因在大肠杆菌中只能表达和人胰岛素原，要经进一步的加工后才能获得具生物活性的胰岛素。甲生物乙生物取出优秀基因“剪切”“拼接”新类型表达新的生物产品基因敲除技术转基因技术生物新类型敲除不利基因新的生物产品能力提升：人的糖蛋白必须经过内质网和高尔基体进一步加工合成，通过转基因技术，可以使人的糖蛋白基因得以表达的受体细胞是（）A大肠杆菌B酵母菌CT4噬菌体D质粒DNAB知识延伸——DNA分子杂交技术该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链DNA解开，把单股的DNA小片段用同位素、荧光分子或化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的DNA中的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的DNA或基因。基因探针（DNA探针）与目的基因杂交，有无杂交带基因工程的基本操作程序目的基因的获取形成重组DNA分子；将目的基因导入受体细胞筛选含有目的基因的受体细胞和目的基因表达1、从基因文库中获取目的基因2、利用PCR技术扩增目的基因3、化学方法人工合成农杆菌转化法、基因枪法、显微注射法、Ca2+处理法DNA分子杂交技术、抗原—抗体杂交技术分子检测外的个体水平鉴定四、本节小结：例如：将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。无表达产物无表达产物有表达产物无表达产物1、用基因工程技术可使大肠杆菌合成人的蛋白质。下列叙述不正确的是A．常用相同的限制性内切酶处理的基因和质粒B．DNA连接酶和RNA聚合酶是构建重组质粒必需的工具酶C．可用含抗生素的培养基检测大肠杆菌中是否导入了重组质粒D．导入大肠杆菌的目的基因不一定能成功表达B巩固练习2下列属于获取目的基因的方法的是()①利用mRNA反转录形成②从基因组文库中提取③从受体细胞中提取④利用PCR技术⑤利用DNA转录⑥人工合成A．①②③⑤B．①②⑤⑥C．①②③④D．①②④⑥D3基因工程又叫基因拼接技术。(1)在该技术中，用人工合成方法获得目的基因的途径之一是：以目的基因转录的为模板，成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成。(2)基因工程中常用的受体细胞有细菌、真菌、。(3)假设以大肠杆菌质粒作为运载体，并以同一种限制性内切酶切割运载体与目的基因，将切割后的运载体与目的基因片段混合，并加入DNA连接酶。连接产物至少有种环状DNA分子，它们分别是。信使RNA逆转录双链DNA(目的基因)动植物细胞3运载体自连的、目的基因片段自连的、运载体与目的基因片段相连的环状DNA分子4如何利用目的基因，通过转基因技术获得抗寒能力提高的香蕉植株？在运用转基因香蕉的过程中，在生态安全方面可能会出现什么问题？（列举两点）将目的基因插人土壤农杆菌的质粒，构建表达载体，通过农杆菌的转化导人香蕉受体细胞，成功转化的香蕉细胞通过组织培养形成植株。生态安全问题包括：①外源基因扩散到其他物种（外源基因漂移）；②转基因植株扩散影响生态系统的结构和功能；③转基因植株扩散对生物多样性的影响；④转基因植物残体或分泌物对环境的影响。剪切拼接导入表达（一）获得目的基因（二）形成重组DNA分子（三）将重组DNA分子导入受体细胞(四)筛选含有目的基因的受体细胞(五)目的基因的表达四、基因工程的基本操作步骤步骤一获得目的基因人工合成利用PCR技术扩增已知序列：从基因文库获得未知序列：(DNAlibrary)聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction)化学合成鸟枪法供体细胞DNA限制酶许多DNA片段载入运载体导入受体细胞扩增产生特定性状分离目的基因•从基因文库获得PCR技术•原理：•前提：•条件•方式DNA复制一段已知目的基因的核苷酸序列：以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）指数2n模板DNA、两个DNA引物、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）过程变性、退火、延伸三步曲变性：加热至90～95℃双链DNA解链成为单链DNA退火：冷却至55～60℃部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合延伸：加热至70～75℃以目的基因为模板，合成互补的新DNA链变性退火延伸目的基因的检测与表达检测①导入检测：目的基因是否导入受体细胞方法——DNA分子杂交②表达检测转录检测——分子杂交翻译检测——抗原抗体杂交分子检测法鉴定抗虫鉴定抗病鉴定活性鉴定等个体水平的鉴定