体内小鼠实验方案

实验报告抗肿瘤药物体内活性研究一、实验原理聚合物胶束的粒径约为0-200nm，可以利用肿瘤组织的增强渗透保留效应(EPR)，选择性地透过肿瘤血管并积累在肿瘤组织，实现被动靶向；被特定官能团修饰的聚合物胶束则能响应部位的物理化学变化，实现靶向部位的载体聚集和药物定点释放。抗肿瘤药物的反复使用容易导致肿瘤细胞产生多药耐药性(MDR)，肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物产生耐药性后，对结构与作用机制不同的其它抗肿瘤药产生交叉耐药的现象极大的限制了化疗药物的疗效。纳米药物传递系统如脂质体、胶束、纳米粒等作为MDR逆转策略越来越引起关注。胶束能通过EPR效应使药物选择性地在肿瘤部位累积和释放，增加细胞内药物浓度，缓控释药物，并通过靶向细胞上特异受体对应的配体修饰，达到主动靶向，从而逆转肿瘤细胞耐药。盐酸阿霉素(DOX·HCl)，属于蒽环类抗生素，能够抑制癌细胞遗传物质核酸的合成，具有广谱的恶性肿瘤的治疗效果，广泛用于宫颈癌细胞、卵巢癌、乳腺癌、恶性淋巴瘤、肺癌、肝癌等的治疗。然而，阿霉素的急性和慢性毒副作用限制了其在临床上的广泛应用，急性毒副作用包括恶心、呕吐、骨髓抑制和心率失常;慢性毒性表现为肝脏、大脑和肾脏的损伤，对心脏具有不可逆的剂量依赖性的损伤。用聚合物构建新型药物胶束传递系统，提高对疏水性药物的包载能力和药物稳定性;通过小分子修饰实现被动和主动靶向。此外,通过相关实验考察作为药物载体的聚合物胶束的耐药能力，以此来证明聚合物胶束的生物安全性好、稳定性高、载药量高、响应性强、靶向性准、缓控释性能好。二、实验目的1.运用抗肿瘤药物在小鼠体内评价方法，筛选出具有高表达、特异性、高亲和力的主动/被动靶向、无细胞毒性、抗肿瘤效果好的聚合物胶束。2.动物体内抑瘤实验基于活体成像技术，建立药物抗肿瘤效果活体动物影响研究方法。三、实验内容1.动物模型将状态良好的细胞消化，用培养液稀释至1×106cells/mL细胞密度，吹匀后于每只小鼠加入细胞悬液100μL，培养。受试溶液每孔加入100μL，每个浓度3-5个平行孔，每组10-15只裸鼠；对照组，即不加待测药液，单一补加100μL生理盐水，培养。2.体内抑瘤实验给药后观察裸鼠体内肿瘤体积变化情况。3.裸鼠在给药2和12天后处死，取血液、心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、肿瘤组织，置于近红外成像系统观察。四、实验方案1.动物模型的建立通过MTT实验选取生物活性好、稳定性高、载药量高的聚合物纳米颗粒（NPs），为了考察不同给药剂量的DOX-NPs(阿霉素负载聚合物纳米颗粒)和DOX·HCl溶液的抗肿瘤效果，选取HeLa细胞常规培养，待细胞扩增至一定数量，且生长状态良好，取对数生长期的细胞用0.25%胰酶消化2min，l000rpm离心5min，弃去上清液，用新鲜无血清的DMEM培养基重悬细胞沉淀，配制成1×106个细胞/mL的细胞悬液。然后用注射器吸取细胞悬液，排空气泡，注射于体重在20-22g左右的BALB/C雌性裸鼠左腋皮下组织中，每只接种100µL，约含1×105个细胞，大约共接种120只。观察裸鼠肿瘤生长情况，并定期称裸鼠体重，测量肿瘤大小。（实验期间动物正常饮食喝水。）2.给药及抑制肿瘤效果评价当肿瘤体积长到100~150mm3时，将裸鼠随机分成4组，每组10只裸鼠(n=4)，分别为阴性对照组（生理盐水组），DOX·HCl，NPs和DOX-NPs。阴性对照组通过尾静脉注射100µL对照生理盐水。DOX·HCl，NPs和DOX-NPs组分别通过小鼠尾静脉注射100µL的用无菌生理盐水配制的DOX·HCl。并记为第一天。（给药剂量分别为：5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg）。隔天给药一次，给药后小鼠正常饲养，每天观察小鼠的生存状况，每两天记录一次小鼠体重，并用游标卡尺测量小鼠肿瘤的长短径，根据公式计算肿瘤体积（V）和相对肿瘤体积（Relativetumorvolume，RTV），绘制时间-小鼠相对体重和时间-小鼠相对肿瘤体积变化曲线。给药后第12天处死小鼠，摘取皮下肿瘤并称重。肿瘤体积：V=a×b2/2（a为肿瘤的最长径，b为肿瘤的最短径）公式1相对肿瘤体积：RTV=Va/V0（Va为每日肿瘤体积，V0为起始肿瘤体积公式2按照以下公式：计算各给药组的抑瘤率:Tumorinhibitonratio%=(1─Vtest/Vcontrol)100%公式3其中，Vtest为第12天时给药组的相对肿瘤体积，Vcontrol为第12天时生理盐水组的相对肿瘤体积。3.药物体内脏器分布实验由于DOX·HCl自身具有红色荧光，故可通过近红外成像仪观察药物在裸鼠体内各脏器的分布情况。在尾静脉注射5mg/kg生理盐水、游离DOX·HCl、NPs和DOX-NPs组生理盐水溶液后,于第2、12天处死裸鼠,取血液、心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏以及肿瘤置于在体近红外成像系统观察,分析给药后阿霉素在各4.组织切片分析通过肿瘤以及心脏组织切片可以判断不同制剂对肿瘤的抑制作用以及阿霉素对心脏的损伤情况。在尾静脉注射生理盐水、5mg/kg游离DOX·HCl、NPs和DOX-NPs组生理盐水溶液后,在预设时间处死给药后的裸鼠，剖取心脏以及肿瘤组织，通过10%多聚甲醛对组织进行固定(12小时以上)。依次经过50%酒精、70%酒精、80%酒精、90%酒精、95%酒精、100%酒精(两次)进行脱水处理(每级35-45分钟)。100%酒精与二甲苯(1:1)透明处理30-40分钟,再移入二甲苯中15-20分钟。将透明后的组织块置于刚过溶点的融化石蜡中浸渍，取代组织中含有的透明剂，将浸蜡后的组织置于融化的固体石蜡中，石蜡凝固后，组织即被包埋在其中。修整蜡块，并进行切片。经过苏木精-伊红染色（HE染色）或者醋酸铀和硝酸银染色后固定于铜网，通过近红外成像仪或荧光显微镜或TEM观察心脏受损程度以及肿瘤5.统计学处理所有实验数据采用SPSS10.0统计软件分析处理。数据XS表示,组内和组间比较采用方差分析。以P≤0.05为差异有统计学意义。五、实验预期结果1.通过体内小鼠实验，可以筛选出一种具有生物安全性好、稳定性高、载药量高、响应性强、靶向性准、缓控释性好的聚合物胶束。2.同等剂量下，载药胶束组裸鼠存活率大大提高，胶束包载药物后减小了药物的毒副作用，增加了动物的存活率。3.通过观察给药后裸鼠体内肿瘤体积变化情况，说明了聚合物胶束组取得了显著的抑瘤效果。4.肿瘤组织切片进一步证实了DOX-NPs对肿瘤的杀伤能力明显优于游离药物,说明了DOX-NPs增强了普通聚合物胶束的抑瘤效果。六、注意事项1.聚合物纳米颗粒的选取，应考虑其生物安全性、稳定性、载药量、响应性、靶向性、缓控释性能。2.在做肿瘤细胞的时候，往往要根据细胞生长速度以及药物的特性(有时间依赖性和浓度依赖性的药物)来确定培养时间是48小时还是72小时。3.要设置生理盐水组(阳性对照组)和实验组。4.小鼠要随机分组且每组数量不少于10只，并观察其生存状况。5.样品采集时，必须迅速，大小要均匀，不能太大。采集完后立即放入固定液中固定。6.新买的蜡，首次融化凝固后，也容易产生白点沉淀，不能用来包埋组织。因此也要反复熔化-凝固，过滤，直到凝固的蜡，表面光亮，没有白点才能用。在浸蜡过程中，在按照步骤所定的温度，除了调节温度和换蜡外，还有实时观察恒温箱中瓶中的腊，不能让其凝固。假如凝固，升温将其熔化。实验药品：HeLa细胞、BLAB/c雌性裸鼠、胰酶、DMEM培养液、NaCl、DOX·HCl、10%多聚甲醛、乙醇、二甲苯、石蜡、苏木精-伊红染色液、蒸馏水、HCl、PBS缓冲溶液实验仪器：超净台、离心机、移液枪、荧光显微镜、近红外成像仪