药敏试验方法简介

药敏试验方法简介耐药菌问题日益严重“目前药物失去作用的速度与科学家发现新药物的速度差不多。”摘自WHO报告抗微生物治疗面临的困境•抗药性问题始终存在•细菌不断获得新的耐药机制•以往对付耐药性的策略收效不显一、抗菌药物敏感试验（AST）预测抗菌治疗的效果；指导抗菌药物的临床应用；发现或提示细菌耐药机制的存在，指导合理用药，避免产生或加重细菌的耐药；监测细菌耐药性，分析耐药菌的变迁，掌握耐药菌感染的流行病学，以控制和预防耐药菌感染的发生和流行。（1）抗菌药物的选择在我国主要遵循临床实验室标准化委员会（ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute,CLSI）制定的抗菌药物选择原则A组：对特定菌群常规测试并报告的药物B组：可常规测试、选择性报告的药物C组：替代性或补充性药物U组：仅用于泌尿道感染的抗菌药物葡萄球菌属抗菌药物药敏试验推荐分组葡萄球菌属抗菌药物A组苯唑西林（头孢西丁纸片）、克林霉素、青霉素、红霉素、复方新诺明、B组四环素、万古霉素、利奈唑胺C组环丙沙星、庆大霉素、氯霉素、奎奴普汀/达福普汀U组氧氟沙星、呋喃妥因、磺胺异恶唑、甲氧苄啶肠杆菌科抗菌药物敏感试验推荐分组肠杆菌属抗菌药物A组氨苄西林、头孢唑林、庆大霉素B组阿米卡星、奥格门丁、哌拉西林+他唑巴坦、头孢呋新、头孢吡肟、头孢西丁、环丙沙星、亚安培南、哌拉西林、复方新诺明C组头孢他啶、氯霉素、氨曲南、四环素U组羧苄西林、氧氟沙星、呋喃妥因假单胞菌属的抗菌药物药物敏感推荐分组假单胞菌抗菌药物A组头孢他啶、庆大霉素、哌拉西林B组阿米卡星、氨曲南、头孢吡肟、环丙沙星、亚安培南、哌拉西林+他唑巴坦C组U组氧氟沙星不动杆菌属的抗菌药物药敏试验推荐分组不动杆菌属抗菌药物A组氨苄西林/舒巴坦、头孢他啶、亚胺培南、环丙沙星、庆大霉素B组阿米卡星、哌拉西林+他唑巴坦、头孢吡肟、头孢噻肟、复方新诺明、哌拉西林、四环素肠球菌属抗菌药物药敏试验推荐分组肠球菌属抗菌药物A组氨苄西林、青霉素B组万古霉素、利奈唑胺C组庆大霉素(120μg)、链霉素(300μg)U组环丙沙星、四环素、呋喃妥因肺炎链球菌抗菌药物药敏试验推荐分组肺炎链球菌抗菌药物A组青霉素、苯唑西林(1μg)、红霉素、复方新诺明B组万古霉素、克林霉素、四环素、氧氟沙星C组氯霉素、利奈唑胺药敏试验的折点亦遵照每年最新公布的CLSI标准进行，分为敏感（S）、耐药（R）和中介（I）。敏感：分离菌株能被测试药物使用推荐剂量时在感染部位通常可达到的抗菌药物浓度所抑制耐药：分离菌株不能被测试药物常规剂量可达到的药物浓度所抑制；分离菌株可能存在某些特定的耐药机制；治疗研究显示药物对分离菌株的临床疗效不可靠耐药＝治疗无效；敏感≠治疗有效二、抗菌药物的种类及作用机制三、药敏试验方法学•纸片扩散法（K-B法）•稀释法（MIC法）–肉汤稀释法•常量稀释法•微量稀释法–琼脂稀释法•E-test法1.手工试验2.自动仪器药敏系统纸片扩散法（K-B法）原理：抑菌圈的大小反映受试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关。耐药中介敏感RISLog2.MICd1d2抑菌圈直径（mm)MIC与抑菌圈直径的线性关系1.准备抗菌药物纸片和水解酪蛋白（M-H）培养基；2.挑取孵育16～24小时已分纯菌落，置于生理盐水管中，振荡混匀后校正浓度至0.5麦氏标准；3.用无菌棉拭子蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余菌液，然后在MH琼脂表面均匀涂布接种3次，每次旋转平板60度，最后沿平板内缘涂抹1周；4.平板在室温下干燥3～5min，用无菌镊子或商品化的纸片分配器将含药纸片紧贴于琼脂表面；5.35℃孵育16～24小时，量取抑菌圈直径；6.根据抑菌环的直径，按照CLSI标准判读，报告敏感、中介、耐药。2019/10/723CLSI对K-B法的标准化规定纸片药物含量、细菌接种浓度、培养基、平皿厚度、孵育时间、环境、判定标准、质控方法等；常规测试、报告的抗生素。不同的药判定标准不同；不同的菌判定标准也不同。2019/10/7扩散法药敏影响因素培养基pH值7.2-7.4营养程度（肠球菌能生长）厚度抗生素拮抗剂含量（用29212监控）钙镁离子含量、锌离子含量（用27853氨基糖苷类和亚胺配能结果监控）菌悬液浓度高抑菌环缩小（假耐药）浓度低则扩大（假敏感）•细菌纯度•气体环境–普通细菌放CO2时由于碳酸的影响，药物活性受到影响，形成假敏感或假耐药–苛养菌放普通环境生长不良，导致假敏感•培养时间–粘液性铜绿需48小时•测量方法稀释法以一定浓度的抗菌药物与含有受试菌的培养基进行一系列不同倍数稀释（通常为双倍稀释），培养16～24h后，通过观察细菌生长现象来测得药物对受试菌的最低抑菌浓度（MIC）。2019/10/7稀释法（MIC法）MIC法：分为常量法和微量法常量法：肉汤稀释法、琼脂稀释法微量法：微量肉汤稀释法简化双浓度折点法ATB药敏简化常规浓度分布MIC法BD、德灵药敏动力学计算MIC法VITEK32、VITEK2药敏肉汤稀释法不生长=抗生素抑制细菌生长生长=抗生素无法抑制细菌生长MIC(最小抑菌浓度)=抗生素可抑制细菌生长的最小浓度。.250.512481632MIC=8IncreasingAntibioticConc.常量稀释法药敏试验的参考方法：将标准接种物加入含対倍稀释抗生素的MH肉汤管中.过夜培养.MIC即是能抑制细菌生长的含最低抗生素的浓度的那一管所标示的浓度值(琼脂稀释法是将対倍稀释后的抗生素加入融化后平衡到50℃的MHA中再倾制平皿，接种物为一定大小的斑点，浓度也为104CFU/ml).解释标准(SorR)是建立在体内可达到的抗生素浓度水平上104cfu/ml4210.50.250.120mg/ml微量肉汤稀释法接种后应充分混匀，但不能有气泡产生静置培养培养温度；35℃气体环境：所有细菌（包括苛养菌）均置大气环境；厌氧菌置厌氧环境；微需氧菌置微需氧环境；淋菌琼脂稀释法置CO2培养时间：18小时药敏结果报告可用MIC（μg/ml）或对照CLSI标准用S、R和I报告。对于稀释法的批量试验，有时需要报告MIC50、MIC90。2019/10/7稀释法药敏影响因素培养基pH值7.2-7.4营养程度抗生素拮抗剂含量钙镁离子含量（钙10-25；镁10-12.5μg/ml）菌悬液（5×104CFU/ml）接种效应浓度高MIC抬高浓度低MIC压低•细菌纯度•气体环境–所有需氧细菌均放普通大气环境。如果放CO2，由于碳酸的影响，药物活性受到影响，形成假敏感或假耐药•培养时间–真菌需48小时–奴卡菌需5天E-test法将稀释法和扩散法的原理结合起来，直接测定药物对受试菌的MIC。2019/10/7MIC值标注于试条的光面Etest试条毛面贴于MHA上Etest操作程序按照扩散法标准操作涂布接种贴上试条并培养15-18小时读取抑菌浓度并按标准解释细菌生长区E试条细菌生长抑制区25612880.16判读MIC2019/10/7肺炎链球菌青霉素MIC=3mg/ml结果读取BDPhoenixTM-100凤凰全自动细菌鉴定/药敏检测系统最大的标本容量：对100个标本同时进行鉴定与药敏测试！鉴定部分：51孔鉴定实验改良经典实验显色＋荧光检测无需附加实验与试剂药敏部分：85孔药敏实验比浊＋氧化还原（专利）实测倍比稀释MIC值药物种类与浓度梯度最多耐药机制检测同步进行封闭式设计，安全无泄漏先进的鉴定/药敏复合板设计PhoenixTM100鉴定板革兰氏阳性板、革兰氏阴性板生化反应组合LOCSUB-CODELOCSUB-CODELOCSUB-CODEA1BALLB1CLSTC1ACTA2BGENB2DMNTC2ADOA3DEXB3CITC3MLOA4DGALB4PXBC4KGAA5DFRUB5LTRYC5TIGA6DGUAB6LPYRC6LYALDA7DMLBB7LPROBC7GUGAHA8LARAB8LARGHC8GLPRBA9MBGUB9FLR_CTLC9FLR_CTLA10NGAB10LPHETC10GLYBA11NGUB11NAGC11ARARRA12DSBTB12LGTAC12LLEUHA13DSUCB13ORNC13UREA14GRAB14LPROTC14BPHOA15MTUB15LGGHC15BDGLUA16LRHAB16ESCC16A17B17C17LOCSUB-CODELOCSUB-CODELOCSUB-CODEA1BGENB1MTTC1DTAGA2DSUCB2NGUC2MALA3DGUAB3DTREC3DEXA43MGAB4BDCELC4ARARRA5DFRUB5LALTC5GLPRBA6IMNB6BDGLUC6BDGLCA7CLSTB7LPROBC7LLEUHA8PXBB8LPYRC8NAGA9KGAB9FLR_CTLC9FLR_CTLA10DMNTB10LPHETC10LARGHA11MAAB11LTRYC11PHOTA12THYB12PHOSC12LHISTA13PAGLUB13METAC13LISOA14PHOLB14ADGLUC14BDGALA15VAALAB15ALALHC15UREA16LPROTB16ESCC16NCFA17B17C17革兰氏阳性菌鉴定板革兰氏阴性菌鉴定板鉴定部分：51孔鉴定实验,改良经典实验显色＋荧光检测,无需附加实验与试剂革兰氏阳性板条位置代码位置代码位置代码A1BETA-龙胆二糖B1麦芽丙糖C1D-塔格糖A2蔗糖B2N-乙酰-葡糖胺C2麦芽糖A3D-葡糖酸B3D-海藻糖C3DEDXTROSEA43-甲基戊二酸B44MU-BD-纤维二糖糖苷C4精氨酸-精氨酸-AMCA5D-果糖B5L-丙氨酸-AMCC5苷氨酸-脯氨酸-AMCA6亚氨基二乙酸B6PNP-BD=葡糖苷C64MU-BD-葡糖苷酸A7多粘菌素EB7L-脯氨酸-AMCC7L-亮氨酸-AMCA8多粘菌素BB8L-焦谷氨酸-AMCC84MU-N-乙酰-BD-氨基葡糖苷A9ALPHA-酮戊二酸B9荧光对照孔C9荧光对照孔A10D-甘露醇B10L-苯丙氨酸-AMCC10L-精氨酸-AMCA113-甲基-已二酸B11L-色氨酸-AMCC114MU-磷酸盐(with海藻糖)A12胸苷B124MU-磷酸盐C12L-组氨酸-AMCA13PNP-AD-葡糖苷B13蛋氨酸-AMCC13L-异亮氨酸-AMCA14PNP-磷酸盐B144MU-AD-葡糖苷C144MU-BD-半乳糖苷A15缬氨酸-丙氨酸-PNAB15丙氨酸-丙氨酸-PNAC15尿素A16L-脯氨酸-NAB16七叶酸C16硝噻吩A17B17C17革兰氏阴性板位置代码位置代码位置代码A1BETA-阿洛糖B1多粘菌素EC1乙酸A2BETA-龙胆二糖B2D-甘露醇C2福寿草醇A3DEDXTROSEB3柠檬酸盐C3丙二酸A4D-半乳糖B4多粘菌素BC4ALPHA-酮戊二酸A5D-果糖B5L-色氨酸-AMCC5顺芷酸A6D-葡糖酸B6L-焦谷氨酸-AMCC6赖氨酸-丙氨酸-AMCA7D-蜜二糖B7L-脯氨酸-AMCC7戊二酰-苷氨酸-精氨酸-AMCA8L-阿拉伯糖B8L-精氨酸-AMCC8苷氨酸-脯氨酸-AMCA9甲基-B-葡糖苷B9荧光对照孔C9荧光对照孔A10N-乙酰-氨基半乳糖B10L-苯丙氨酸-AMCC10苷氨酸-AMCA11N-乙酰-葡糖胺B114MU-N-乙酰-BD-氨基葡糖苷C11精氨酸-精氨酸-AMCA12山梨醇B12L-谷氨酸-AMCC12L-亮氨酸-AMCA13蔗糖B13鸟氨酸C13尿素A14半乳糖醛酸B14L-脯氨酸-NAC14BIS(PNP)磷酸盐A15麦芽酮糖B15GAMMA-L-谷氨酰-NAC15PNP-BD=葡糖苷A16L-鼠李糖B16七叶酸C16A17B17C17鉴定实验方法在研究了上百种反应底物基础上，选择了45种反应底物。检测板每20分钟检测一次Green