Sf9细胞的培养及转染

Sf-9细胞的培养及转染Sf-9细胞•Sf-9细胞是由G.E.Smith和C.L.Cherry在1983年从细胞株IPLB-SF21AE得来的一个克隆。IPLB-SF21AE是1977年由Vaughn等从草地夜蛾蛹的卵巢组织得到的。•Sf-9是半贴壁的细胞，贴壁性不强，可贴壁培养也可悬浮培养。Sf-9细胞的形态培养细胞生长的条件•1、细胞的营养需要•2、细胞的生存环境温度:28℃氧pH:7.2-7.4渗透压•3、无污染•4、无毒实验材料：•实验用品：•超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸•生化培养箱•倒置显微镜•酶标仪、微孔板震荡器•液氮罐•自动双重纯水蒸馏器，纯水仪•耗材：•培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板，冻存管超净台超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。生化培养箱•生化培养箱设定的条件为28℃。•使用生化培养箱培养细胞时应注意的问题：•1）保持培养箱内空气干净。定期消毒（90℃，14h)。•2）箱内灭菌蒸馏水3000ml蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避免培养液蒸发。培养瓶拿培养瓶的正确姿势：拇指和食指夹住培养瓶，瓶口向外，中指托住瓶底。保持瓶子的水平，防止培养液倒向瓶口。血球计数板细胞冻存和复苏•冻存和复苏的原则：慢冻快融–当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。–如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反．结晶就大，大结晶会造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。慢冻程序•标准程序：•当温度在-25℃以上时，1～2℃/min•当温度达-25℃以下时，5～10℃/min•当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中细胞冻存•简易程序：•将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降1～2℃的速度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。细胞复苏方法•（1）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～38℃水浴中，使其融化（1分钟左右）。•（2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上。•（3）低速离心10分钟。（4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。Sf9细胞的传代•判断分离（散）细胞培养物是否需要传代的主要指标就是观察培养物是否已基本长满培养瓶皿的底壁。•一般来说，原代培养物未达到生长基质的80%表面面积，不要急于传代，对于拟行首次传代的培养物更如此。•Sf9的分裂周期大概是27小时左右Sf9传代的方法•1）吸取或者倾出旧培养液。•2）加入一定量的新培养基，用吸管吸取培养液，反复吹打瓶皿底壁，使半贴壁的细胞脱离瓶皿底壁。•吹打过程须有序进行，亦即要从一边开始到另一边结束，尤其是器皿的边缘地带和四角处，确保瓶皿底壁各处的细胞均被吹打脱离。吹打时动作不宜过猛，吹出液体的力度要适中，否则会直接损伤细胞并产生能伤害细胞的气泡。或者使细胞碎片增多。•经吹打后，得到细胞悬液。Sf9传代的方法•3）接种在新的培养瓶皿内。一般接种两个或者多个培养瓶皿内。•有时候，传代仅为了使培养物经历并适应传代处理过程，在培养物细胞数量不大的情况下，传代时还只是接种在一个培养瓶皿内。加入培养液。（平时不做实验时，只需要传一瓶）。•（以1：5或更多为宜，每2-3天传代一次）28℃培养（不用CO2培养箱）。•4）送入培养箱中继续培养。细胞培养－换液•对于像Sf9这样的半贴壁的培养物，可按如下步骤操作：•吸去或倾出（部分或全部）旧培养液。•加入新鲜的培养液。加入的量与换液前的量相同。•放回原来的培养箱中继续培养。转染•转染(transfection)指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程。•化学–包括：①DEAE-葡聚糖法②磷酸钙法③人工脂质体法•物理–包括：①显微注射②电穿孔③基因枪•*BacmidBac-to-Bacexpressionsystem•杆状病毒表达系统（BaculovirousExpressionVectorSystem,BEVS）与细菌，酵母，哺乳动物细胞一起被公认为当今世界的基因工程的四大表达系统。特点•能对高效表达的蛋白质进行较完善的翻译后加工，如糖基化，磷酸化，酰基化，信号肽的切除等；•与其他真和细胞表达系统相比能获得重组蛋白的高水平表达，最高甚至可达到细胞总蛋白的50%；•对脊椎动物无感染性，并且也已经证明它们的启动子在大多数的哺乳动物细胞中也是没有活性的，因此这对于表达一些致癌基因和潜在的毒蛋白比其他的表达系统更有优势；•能容纳大分子片段的插入和表达；•能同时在一个细胞和载体上表达多个外源基因；•能保证高表达的外源蛋白在细胞内进行正确的折叠，二硫键的搭配等。杆状病毒•现已知基因组全序列的杆状病毒仅有7种:–苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)–家蚕核多角体病毒(BmNPV)–黄杉毒蛾多核衣壳核多角体病毒(OpMNPV)–舞毒蛾多核衣壳核多角体病毒(LdMNPV)–甜菜夜蛾多核衣壳核多角体病毒(SeMNPV)–棉铃虫核型多角体病毒(HaNPV)–斜纹夜蛾核型多角体病毒(SpltMNPV)多角体蛋白•多角体蛋白是形成包含体（在显微镜下可以识别的病毒合成和积贮的部位，常是细胞内的病毒晶体。它是致密的不溶性蛋白和RNA的凝聚体，包含大部分的表达蛋白。）的主要成分，感染后期在细胞中的积累可高达30%~50%，是病毒复制非必需成分，但对病毒粒子却有保护作用，可使之保持稳定和感染能力。Bacmid•能快速、高效产生的重组AcMNPV病毒。取杆状病毒(baculovirus)和质粒(plasmid)的英文字头字尾命名为Bacmid，即杆状病毒质粒之意。该载体可像质粒一样在大肠杆菌中生长，又对鳞翅目昆虫细胞具有感染性。昆虫杆状病毒表达系统的构成表达过程：1、将外源目的基因插入到启动子下游与杆状病毒重组，获得重组病毒（酶切酶连转化）2、将重组的病毒纯化3、感染昆虫细胞或虫体（转染）4、外源基因随着病毒的复制而获得表达*《人​细​小​病​毒​B​1​9​-X​A​株​V​P​1​蛋​白​在​B​a​c​-t​o​-B​a​c​系​统​中​的​表​达​及​其​反​应​原​性》*《Bac-toBac®BaculovirusExpressionSystem实验流程》转染基本步骤•1、接种细胞并使其贴壁•2、制备重组Bacmid与CellfectinReagent（Invitrogen公司转染试剂）复合物•3、加入复合物•4、去掉复合物混合液，加入完全培养基，培养细胞直到细胞出现病毒感染迹象•5、取上清液分离纯化得目的蛋白