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Superdex75Superdex200前言Superdex™7510/300GL和Superdex20010/300GL均是Tricorn™高效柱。该柱子是用于高效过滤分离蛋白、多肽、小于200bp的DNA片段及其他生物分子的预包装玻璃柱子。该柱子有两个手拧接头1/16，一个用于接AKTAdesign™系统，与一个1/16female/M6male一起接FPLCTM系统。柱子相关数据基底柱床尺寸柱床体积柱效率（N/M）平均粒度通常使用时pH稳定范围清洗时pH稳定范围工作时温度储藏温度复合交联琼脂糖和右旋糖酐10×300–310mm大约24ml30000m-113um3-121-144-40℃4-30℃Superdex75Superdex200球状蛋白的排阻极限约为1×105约为1.3×106球状蛋白最佳分离范围3000-7000010000–600000右旋糖酐（葡聚糖）500–300001000–100000推荐最大流速（水，室温下）1.5ml/min1ml/min柱内最大压力1.8Mpa，18bar，261psi1.5MPa,15bar,218psi初次使用图一展示如何锁接头器。黑色的锁环必须在下防止柱床高度的改变。将柱子连接柱层分析仪之前，要确保管道与阀门处没有气泡。将注资上的储存/输送装置及止塞移除。检查上方的接头器是否锁上（将锁环压下去，见图一）。确认柱子的进口已经注满液体，并且一级级接入系统。平衡后第一次使用或长期存储柱子如下操作：a）至少用50ml蒸馏水在0.5ml/min的速度下清洗50ml洗脱液在0.5ml/min流速下洗涤确保其回压不超过推荐的最大压力值。先以以下条件试一下洗脱液50mM磷酸缓冲液（PBS）0.15MNacl，pH7.0流速室温下，0.5-0.75ml/min样品体积25ul在同样的洗脱缓冲液中就没必要平衡了，认真阅读“优化”这一部分了解如何优化蛋白分离。缓冲液与耐溶剂在喷射阀前安装一个滤器。如果缓冲液与溶剂有增强粘性，那会影响负压与流速。所有的溶剂全都要经过脱气与0.22um滤器过滤。日常使用所有常用缓冲液，pH均在3-12之间尿素8M乙腈达到缓冲液的30%离子型和非离子型洗涤液盐酸胍6M三氟乙酸10%甲酸70%洗涤液乙腈30%氢氧化钠1M乙醇70%甲醇100%乙酸1M异丙醇30%盐酸0.1M禁止：氧化物剂未过滤溶液建议样品状态分子量3000-70000（75）10000-600000（100）蛋白浓度样品中蛋白≤10mg样品体积25-500ul准备将样品溶解于洗脱液，用0.22um的旅途过滤除菌或10000g离心10min。深入信息运输/储存柱子有一个储存/运输装置来保证柱内压，同时防止柱子干掉。柱子用脱气的20%的乙醇平衡。如果柱子后后需要储存2天之上，用2倍柱体积的蒸馏水洗涤，后用制定好2倍柱体积的20%乙醇洗涤。在此提醒要按图一将储存/运输装置连接好以便长期储存。玻璃管用一塑料保护膜套起来，会有少量空气存留在玻璃跟塑料保护膜之间。如何除去其存储/运输设备（见右图）（1）按下弹簧帽（2）移去锁定栓（3）松开帽，把装置拧开如何重装该装置(见右图)(1)在储存或运输装置上接一个注射器或泵，并且往里注入20%的乙醇，超过管子上的刻度线即可。把注射器或泵移除。(2)赶净气泡后，将柱塞压到柱上的刻度线处。如何连接储存/运输设备（见右图）（1）在柱子的进出口接头处注入20%的乙醇，将装好的装置逐级连接在柱子顶部。（2-3）附上弹簧帽，用锁栓固定洗脱液的选择选择一种保证样品完全溶解的洗脱液。也尽量选择一个能简化下游应用程序的洗脱液。例如，若蛋白或多肽是冻干的，则需要挥发性洗脱液。低盐浓度下，基于依赖于pH7.0，酸、碱性蛋白会相互反应，此时推荐使用50mM磷酸钠0.15M氯化钠pH7.0的缓冲液。表一列出了一些常用的洗脱液组分。表一常用洗脱液组分pH洗脱液液或缓冲液特性/应用实例5.00.1M醋酸铵能很好地溶解一些酶，如纤维素酶，其不稳定7.20.05M磷酸盐+0.15M氯化钠生理状态7.80.15M碳酸氢铵适用于分离DNA与蛋白；不稳定，需要现配现用8.00.1MTris-Hcl，1MmEDTADNA、RNA极易溶解8.66M盐酸胍，50mMTris-Hcl适合在非自然状态下纯化蛋白11.50.05M氢氧化钠较好的溶解复合物缓冲液添加剂在适宜缓冲液中添加30%乙腈用于分离疏水性聚合物，易挥发8M尿素（pH﹤7）能溶解大部分聚合物，低尿素浓度下可保持生物活性，对蛋白的氨甲酰化有影响。6M盐酸胍决定亚基的分子量0.1%SDS，Tween或类似物溶解一些蛋白，例如膜蛋白确保与去垢剂彻底平衡过最优化参照“先以以下条件试一下”部分的描述运行第一次。如果结果不满意的话，请考虑以下：操作效果增加流速提高高分子量组分的分辨率；小分子组分的分辨率可能会下降增加样品体积提高分辨率改变有机溶剂的浓度改变专一性一次性连两个柱子由于增加了柱床高度因而提高了分辨率，确保Superdex75的总柱压低于3Mpa，Superdex200的总柱低于2.5Mpa更多信息参见“凝胶过滤，原则/方法”使用手册在线清洗（CIP）在10-20个分离循环后按如下循环进行常规清洗。常规清洗：1、用25ml0.5M的NaoH或者0.5M的乙酸以0.5ml/min的流速清洗柱子；2、接着用25ml蒸馏水洗柱子，然后至少用50ml洗脱液以0.5ml/min的速度清洗。下次使用之前要平衡柱子直至紫外与pH稳定。精密清洗1、更换柱子上的过滤器（因为液体流过时会有杂质被滤器拦截）换过滤器的说明参照过滤器说明。按上述步骤进行常规清洗。根据杂质的特点，前页上的一种洗涤液可能会用到。任何一种清洗方案完成后一般都要用至少两倍柱体积的蒸馏水清洗。如果柱效还没恢复，那么注射含有0.1mg/ml胃蛋白酶，0.1M醋酸，0.5M氯化钠的溶液室温下过夜或者37℃1h。酶处理完之后按“常规清洗”部分描述的步骤清洗柱子。有必要的话可以将柱床顶部2-3mm柱料重悬并用巴斯德管移出。调整适配器将胶上方的空隙消除。检修状况对策柱压过高或分辨率太低确定柱子是这个原因（见下）。如果是这样的话按精密清洗步骤洗柱子。确定系统内的高负压是由柱子某一时刻在样品收集器处有一部分未与运行的泵相连。一次断开每一处与泵的连接，读取相应的压力值从而确定负压是哪造成的。柱中有气泡将80-100ml脱气的洗脱液0.5ml/min的速度过柱子。注意少量空气不会影响柱子的性能。柱子性能的控制用以下步骤来检验柱子的性能样品：100ul0.5%丙酮（5mg/ml）洗脱液：缓冲液或蒸馏水流速：0.75ml/min，室温检测：280nm柱效，用每米的理论塔板数表示，N/m，如下公式计算：N/m=5.54×(vr/w1/2)2×(1000/L)N/m=理论塔板数/米Vr=洗脱峰的距离（米）W1/2=半峰高峰宽（米）L=柱床高度（米）除了上述检修方法外，还可以按图2、3描述的运行功能测试来检测柱效。图2Superdex7510/300GL功能测试的典型色谱图图3Superdex20010/300GL.功能测试的典型色谱图注：峰5、6单纯因形状不同而区分Superdex7510/300柱样品：1、BSA（M67000），8mg/ml2、卵清蛋白（M433000），2.5mg/ml3、核糖核酸酶A（M13700）5mg/ml4、抑肽酶（M6512）2mg/ml5、维生素B12（M1355）0.1mg/ml样品体积：500ul洗脱液：0.05M磷酸缓冲液，0.15M氯化钠，pH7.0流速：0.4ml/min,室温检测：280nmColumnSuperdex20010/300柱样品：1、甲状腺球蛋白（M,669000）5mg/ml2、铁蛋白（M，440000）0.4mg/ml3、BSA（M，67000）8mg/ml4、β-乳球蛋白（M,35000）2.5mg/ml5、核糖核酸酶A(M，13700)5mg/ml6、细胞色素C(M，13600)1.5mg/ml7、抑肽酶(Mr6512)2mg/ml8、维生素B12(Mr1355)0.1mg/ml样品体积：500ul洗脱液：0.05M磷酸缓冲液0.15氯化钠，pH7.0流速：0.4ml/min,室温检测：280nm