微生物原生质体融合育种技术及其应用

微生物原生质体融合育种技术及其应用摘要：工业微生物菌种选育在发酵工业中占有重要地位。微生物原生质体融合(microbialprotoplastfusion)技术具有重组频率高、受结合型或致育型限制小以及遗传物质传递完整等优点,是微生物育种最常用的方法之一。结合相关研究进展,分析了原生质体融合技术的组成,包括制备、再生、融合的影响因素以及融合子的筛选方法,重点评述了原生质体融合技术应用在微生物育种中的最新进展,以及微生物原生质体融合技术的发展前景。关键词：微生物原生质体融合遗传育种基因组重组引言：微生物菌种是发酵工业中的一个关键因素,它决定了发酵过程的成败及某一发酵产品是否具有工业化价值。自然界中的原始菌株大多不具有很高的工业化价值,因此需要对菌株进行选育和改良,以提高产品的质量,降低成本。原生质体融合技术是起源于20世纪60年代的一项重要的菌种改良技术,是将亲株细胞分别去除细胞壁后进行融合,经基因组间的交换重组,获得融合子的过程。与其他育种技术相比,原生质体融合技术具有重组频率高、受结合型或致育型限制小以及遗传物质传递完整且不需要完全了解作用机制等优点,因而被国内外微生物育种学者广泛应用。1974年,匈牙利的Ferenczy成功将白地霉(Geotrichumcandidum)营养缺陷型突变株的原生质体进行融合,使原生质体融合技术首次应用于微生物中。接下来的几十年,该技术的基本实验方法逐步完善,现已作为一项十分有用的技术广泛应用于工业微生物菌种选育中。本文就原生质体融合技术的过程及其应用于微生物育种方面的最新进展做了简要综述,并分析了目前存在的问题及未来的发展方向。1资料和方法：1.1资料来源由第一作者在CNKI进行检索。网址：。英文资料的检索时间范围为2007/2012；中文资料的检索时间范围为2007/2012。英文检索词为“protoplastfusion、research、progressions”；中文检索词为“原生质体融合、应用、研究进展”。1.2入选标准纳入标准：①原生质体融合技术过程及其影响因素。②原生质体在微生物工程中的应用③原生质体技术应用的工业实例。排除标准：①与此文目的无关。②较陈旧的文献。③重复同类研究。1.3质量评估原生质体融合技术的论文56篇，综述性29篇，研究应用型27篇（其中工业应用型20篇）。2结果：2.1纳入文献基本情况初检得到56篇文献，中文50篇，英文6篇。阅读标题和摘要进行初筛，排除因研究目的与此文无关36篇，内容重复性的研究10篇，共保存10篇文献做进一步分析。选取最具代表性的6篇文章进行具体分析。第1篇是对原生质体融合技术及其应用的综述性文章，第2篇研究了影响原生质体融合的因素。第3—6篇是关于原生质体在微生物工程中具体应用的文章，其中第6篇是原生质体融合技术与分子克隆技术相结合的方法，体现了原生质体发展的新方向。2.2结果描述2.2.1原生质体融合技术原生质体融合技术一般分成五大步骤:直接亲本及其遗传标记选择,双亲本原生质体制备和再生,亲本原生质体诱导融合,融合重组体筛选,遗传特性分析和测定。2.2.1.1原生质体的制备和再生原生质体的制备首先要去除细胞壁,当前去壁的方法主要有机械法、非酶法和酶法,现在使用较多的为酶法。在放线菌和细菌中,主要采用溶菌酶,酵母菌和霉菌一般用蜗牛酶、消解酶或纤维素酶等。2.2.1.2原生质体的融合由于在自然条件下,原生质体发生融合的频率非常低,因此在实际育种过程中要采用一定方法进行人为诱导融合。在微生物原生质体融合中,诱导融合方法主要有化学法(一般采用PEG结合高Ca2+、pH诱导法)、物理法(包括电融合和激光诱导融合法等)。2.2.1.3融合子的筛选利用营养缺陷型标记筛选融合子：融合双亲为不同的营养缺陷型,原生质体融合后于基本培养基进行培养。由于双亲都丧失了合成某种物质的能力,在基本培养基上不能生长,而在融合子中,缺陷的遗传物质得到互补,所以可在基本培养基上长出菌落,利用这种方法即可检出融合子。利用抗药性标记筛选融合子：微生物的抗药性是由遗传物质决定的,不同种微生物对同种药物的抗性存在差异,利用这种差异即可对融合子进行筛选。利用灭活标记筛选融合子：通过灭活标记筛选融合子是指将单亲或双亲的原生质体经紫外线照射、加热或经过某些化学药剂处理,使其丧失在再生培养基上再生的能力,两亲株融合后,融合子损伤互补,因而可在再生培养基上存活。利用荧光染色标记筛选融合子：在制备原生质体时,向酶解液中加入不同荧光色素,使双亲原生质体在特定波长下呈现不同颜色,原生质体融合后,直接选出带有两色荧光的融合子即可。利用某些特殊的生理特征作为标记筛选融合子：利用亲本对营养物质利用及固氮能力方面的差异来筛选融合子。利用生化测定指标选择融合子：通常测定的生化项目有DNA含量、氨基酸量、酸性磷酸酶、同工酶和电泳等。DNA含量的测定有两种方法:一是提取DNA后,以紫外分光光度计测定其含量;二是直接以显微分光光度计测定孢子或菌丝的DNA含量,一般来说,融合子的DNA含量高于任何一个亲本的博莱霉素(IJK)含量,但却少于双亲DNA含量之和。一般情况下,比较融合子与双亲氨基酸含量百分比,电泳测定亲本和融合子酸性磷酸酶同工酶和酯酶同工酶酶谱,两者的酶谱存在着一定的差异。常被用作非人工标记鉴别融合子的辅助性方法。2.2.2影响原生质体融合技术的因素2.2.2.1影响原生质体制备的因素培养基成分对原生质体制备的影响：用酶分解微生物细胞壁,首先要培养菌体或菌丝体。菌体生长的培养基对原生质体化有明显影响,并且这种影响视微生物而异。原生质体化前在培养基中加入某些物质阻止细胞壁的合成,可以提高酶解的效果。培养方式对原生质体制备的影响：不同菌种或同一菌种用同一的培养方法原生质体化效果可能不一样,丝状真菌常用平板玻璃纸法,细菌和酵母菌多用液体震荡培养。菌龄对原生质体制备的影响:微生物生理状态是原生质体化的重要影响因素之一。菌龄过长,菌丝细胞壁老化增厚,不易于释放原生质体;过短则菌丝体容易破裂,释放原生质体数量较少。一般年轻菌丝和顶端菌丝有利于原生质体的制备和再生。菌体浓度对原生质体制备的影:酶解时一般先将菌液离心收集菌丝体,然后加入一定量的酶液。适合的菌体密度可让细胞与酶充分接触反应,提高酶解效果。菌丝体密度一般以3ml酶液中加入300mg新鲜菌丝体为宜。酶系和酶浓度对原生质体制备的影响:利用酶分解细胞壁,由于各菌种细胞壁的成分和结构存在差异,因此不同的菌株所用酶的种类和浓度都有很大差异。酶的种类、浓度是制备原生质体最关键的因素。细菌一般采用溶菌酶去壁,浓度为0.02~0.5mg/ml。酶解时间对原生质体制备的影响：酶解时间的长短直接影响原生质体化的效果,处理时间过短,脱壁不完全;处理时间过长,会导致原生质体脱水皱缩,再生率显著降低。时间从20min~10h不等。温度对原生质体制备的影响：不同的酶均有各自的最适酶解温度。酶解时温度选择的原则是既有利于原生质体化,又能防止原生质体被破坏。细菌的最适酶解温度一般为35~37e或42e,真菌的最适酶解温度为30~35e,放线菌的最适酶解温度为28~37e。pH值对原生质体制备的影响：酶解时的pH值随酶和菌种有一定的差异,需根据实际情况对pH值进行优化。pH6.0对菌种S-37原生质体制备有利。缓冲液和稳定剂对原生质体制备的影响：细胞壁脱去后,原生质体必须在高渗环境中保存及生长,否则会因为渗透压而破裂。稳定剂类型和渗透压也是原生质体制备的重要因素。选用合适的稳定剂不仅能获得较高的原生质体制备率,而且得到的原生质体大小较均匀。常用的缓冲液有磷酸缓冲体系和柠檬酸缓冲体系。渗透压稳定剂分为两类:一类是盐溶液系统,包括NaCl、KCl、MgSO4、CaCl2,浓度为0.3~1.0mol/L;一类是糖溶液系统,包括蔗糖、甘露醇、山梨醇、木糖、纤维二糖、鼠李糖等,浓度为0.3~0.6mol/L。一般认为易于渗入细胞膜或易被分解的物质不宜作稳定剂。酶解方式对原生质体制备的影响：制备原生质体时轻轻摇动或敲击管壁可让酶与菌体混合更均匀,并保持良好的通气条件,有利于提高原生质体率。有人曾对比了用试管、锥形瓶和培养皿等容器制备原生质体的效果,结果使用培养皿时原生质体分离效果最好,原生质体制备率高于试管或锥形瓶3~5倍。2.2.2.2影响原生质体融合的因素融合剂PEG对原生质体融合的影响：仅将原生质体混合在一起融合频率并不高,需要添加PEG(聚乙二醇)提高融合率。PEG的相对分子量和浓度高低对融合都有较大影响。PEG的浓度一般为30%~50%,浓度过高会导致原生质体皱缩甚至中毒,过低导致原生质体破裂。PEG的相对分子量从1000~6000不等,因菌种不同而定。融合时间和温度对原生质体融合的影响：PEG处理时间是融合的最关键因素之一,尤其是对高Ca2+和高pH值溶液处理时,时间长短非常重要。PEG溶液加入后,原生质体间即强烈地发生黏着,融合能长时间有效进行,因此PEG处理的时间常很短。融合处理时间1~60min,大多数情况下为1~10min。由于PEG有一定的毒性,处理时间过长,会导致原生质体失活。温度对原生质体融合也有一定的影响。细胞膜在较高温度下流动性增加,PEG黏度下降,有利于原生质体的融合。融合菌株间的亲和力对原生质体融合的影响：到目前为止,并不是所有的菌种间都能利用原生质体融合技术进行融合,其中很大一部分原因是亲本菌株间的亲源关系造成的。虽然原生质体融合技术能够跨越种、属的界限,但某些远源关系的菌株融合后融合子重组染色体不稳定,容易发生分离现象。另外,原生质体的活性不高也会导致融合率低下。无机离子对原生质体融合的影响:原生质体融合过程中需要一定量的Ca2+和Mg2+促进融合,而K+、Na+会显著降低融合率,融合时一般Ca2+0.01mol/L、Mg2+0.02mol/L为佳。各菌种间略有差异。2.2.2.3培养基对原生质体再生的影响再生培养基的组成对原生质体的再生影响相当明显,培养基中碳源会影响微生物原生质体的再生率。在菌体生长培养基中添加适量的某些营养因子可有效提高再生率,常用的有酵母膏、蛋白质、氨基酸、水解酪蛋白、琥珀酸钠等。稳定剂对原生质体再生的影响:稳定剂的种类和渗透压的大小是原生质体保持形状不破裂的关键因素,也是原生质体再生中的重要影响因素。一般情况下,再生培养基中的最适稳定剂和最佳渗透压与酶解时类似,可以参照酶解时的条件进行。酶解浓度和时间对原生质体再生的影响:酶解浓度和时间不仅仅影响原生质体制备,而且还会影响到原生质体再生。酶浓度过高,时间过长,细胞壁去除完全,可以有效提高原生质体制备率。但细胞脱壁太彻底,必然会影响原生质体的再生率。再生方式对原生质体再生的影响:原生质体的再生可以通过固体或液体培养两种方式完成,同液体培养法相比,固体培养法明显有利于原生质体的再生。微生物细胞去壁后很容易因为机械压力而破裂,可采用双层平板法再生:下层为固体培养基,上层为半固体培养基,中间摊布原生质体。原生质体密度对原生质体再生的影响:再生时再生培养基上的菌体密度不能过高,否则先生长出的菌落会后覆盖生长的菌落。其它因素对原生质体再生的影响:菌龄、预培养、残存菌体等因素对原生质体再生也有一定的影响,可以参考制备时的条件。2.2.3原生质体融合技术的研究进展原生质体融合技术在微生物育种中的应用已经相当广泛，应用范围主要包括以下几方面。改良菌种遗传特性：酿酒酵母是酿酒生产的菌种，在发酵后期，那些能凝集并形成絮状的酵母称凝集性酵母，而那些沉淀性不好的酵母称为粉状酵母。具有良好凝集性的酵母可使酿酒发酵液澄清速度加快，降低酵母分离时的能量消耗，并且还可防止酵母在发酵液中长时间悬浮，导致细胞自溶而影响啤酒的风味。酿酒酵母的凝集特性由其本身的遗传特性决定，一般凝集性较好的酿酒酵母往往发酵度偏低。如果应用原生质体融合技术就能选育出具有较高的发酵度又具有较强的凝集性的融合重组菌株。优化菌种发酵特性：许多微生物能在较高的温度下生存，有的能在45℃～65℃甚