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验证专题-干热灭菌柜、湿热灭菌柜的验证策略（包含培养箱、隧道烘箱、稳定性试验箱、干燥烘箱）1/28一、法规要求：1、无菌药品附录第六十一条无菌药品应当尽可能采用加热方式进行最终灭菌，最终灭菌产品中的微生物存活概率（即无菌保证水平，SAL）不得高于10-6。采用湿热灭菌方法进行最终灭菌的，通常标准灭菌时间F0值应当大于8分钟，流通蒸汽处理不属于最终灭菌。对热不稳定的产品，可采用无菌生产操作或过滤除菌的替代方法。2、无菌药品附录第六十三条任何灭菌工艺在投入使用前，必须采用物理检测手段和生物指示剂，验证其对产品或物品的适用性及所有部位达到了灭菌效果。3、无菌药品附录第六十四条应当定期对灭菌工艺的有效性进行再验证（每年至少一次）。设备重大变更后，须进行再验证。应当保存再验证记录。4、无菌药品附录第六十五条应当通过验证确认灭菌设备腔室内待灭菌产品和物品的装载方式。5、无菌药品附录第六十七条应当按照供应商的要求保存和使用生物指示剂，并通过阳性对照试验确认其质量。使用生物指示剂时，应当采取严格管理措施，防止由此所致的微生物污染。6、无菌药品附录第六十九条每一次灭菌操作应当有灭菌记录，并作为产品放行的依据之一。7、无菌药品附录第七十条热力灭菌通常有湿热灭菌和干热灭菌，应当符合以下要求：（一）在验证和生产过程中，用于监测或记录的温度探头与用于控制的温度探头应当分别设置，设置的位置应当通过验证确定。每次灭菌均应记录灭菌过程的时间-温度曲线。采用自控和监测系统的，应当经过验证，保证符合关键工艺的要求。自控和监测系统应当能够记录系统以及工艺运行过程中出现的故障，并有操作人员监控。应当定期将独立的温度显示器的读数与灭菌过程中记录获得的图谱进行对照。（二）可使用化学或生物指示剂监控灭菌工艺，但不得替代物理测试。（三）应当监测每种装载方式所需升温时间，且从所有被灭菌产品或物品达到设定的灭菌温度后开始计算灭菌时间。（四）应当有措施防止已灭菌产品或物品在冷却过程中被污染。除非能证明生产过程中可剔除任何渗漏的产品或物品，任何与产品或物品相接触的冷却用介质（液体或气体）应当经过灭菌或除菌处理。8、无菌药品附录第七十一条湿热灭菌应当符合以下要求：（一）湿热灭菌工艺监测的参数应当包括灭菌时间、温度或压力。腔室底部装有排水口的灭菌柜，必要时应当测定并记录该点在灭菌全过程中的温度数据。灭菌工艺中包括抽真空操作的，应当定期对腔室作检漏测试。（二）除已密封的产品外，被灭菌物品应当用合适的材料适当包扎，所用材料及包扎方式应当有利于空气排放、蒸汽穿透并在灭菌后能防止污染。在规定的温度和时间内，被灭菌物品所有部位均应与灭菌介质充分接触。9、无菌药品附录第七十二条干热灭菌符合以下要求：验证专题-干热灭菌柜、湿热灭菌柜的验证策略（包含培养箱、隧道烘箱、稳定性试验箱、干燥烘箱）2/28（一）干热灭菌时，灭菌柜腔室内的空气应当循环并保持正压，阻止非无菌空气进入。进入腔室的空气应当经过高效过滤器过滤，高效过滤器应当经过完整性测试。（二）干热灭菌用于去除热原时，验证应当包括细菌内毒素挑战试验。（三）干热灭菌过程中的温度、时间和腔室内、外压差应当有记录。10、中国药典（2015版）第四部1421：灭菌法10.1灭菌程序的验证是无菌保证的必要条件。灭菌程序经验证后，方可交付正式使用。验证内容包括：(1)撰写验证方案及制定评估标准。(2)确认灭菌设备技术资料齐全、安装正确，并能处于正常运行(安装确认）。(3)确认灭菌设备关键控制和记录系统能在规定的参数范围内正常运行（运行确认）。(4)采用被灭菌物品或模拟物品按预定灭菌程序进行重复试验，确认各关键工艺参数符合预定标准，确定经灭菌物品的无菌保证水平符合规定(性能确认）。(5)汇总并完善各种文件和记录，撰写验证报告。日常生产中，应对灭菌程序的运行情况进行监控，确认关键参数(如温度、压力、时间、湿度、灭菌气体浓度及吸收的辐照剂量等)均在验证确定的范围内。灭菌程序应定期进行再验证。当灭菌设备或程序发生变更（包括灭菌物品装载方式和数量的改变）时，应进行重新验证。10.2湿热灭菌法：通常采用121℃×15min、121℃×30min或116℃×40min的程序，也可采用其他温度和时间参数，但无论采用何种灭菌温度和时间参数，都必须证明所采用的的灭菌工艺和监控措施在日常运行过程中能确保物品灭菌后的SAL≤10-6。当灭菌程序的选定采用F0值概念时，应采取特别措施确保被灭菌物品能得到足够的无菌保证，此时，除对灭菌程序进行验证外，还必须在生产过程中微生物进行监控，证明污染的微生物指标低于设定的限度。对热稳定的物品，灭菌工艺可首选过度杀灭法，以保证被灭菌物品获得足够的无菌保证值。热不稳定性物品，其灭菌工艺的确定依赖于在一定的时间内，一定的生产批次的被灭菌物品灭菌前微生物污染的水平及其耐热性。因此，日常生产全过程应对产品中污染的微生物进行连续地、严格地监控，并采取各种措施降低物品微生物污染水平，特别是防止耐热菌的污染。热不稳定性物品的F0值一般不低于8分钟。湿热灭菌法应确认灭菌柜在不同装载时可能存在的冷点。当用生物指示剂进一步确认灭菌效果时，应将其置于冷点处。本法常用的生物指示剂为嗜热脂肪芽孢杆菌孢子(SporesofBacillusstearothermophilus)。10.3干热灭菌法干热灭菌条件一般为（160~170℃）×120min以上、（170~180℃）60min以上或250℃×45min以上,也可采用其他温度和时间参数。无论采用何种灭菌条件，均应保证灭菌后的物品的SAL≤10-6。采用干热过度杀灭后的物品一般无需进行灭菌前污染微生物的测定。250℃×45min的干热灭菌也可除去无菌产品包装容器及有关生产灌装用具中的热原物质。采用干热灭菌时，被灭菌物品应有适当的装载方式，不能排列过密，以保证灭菌的有效性和均一性。干热灭菌法应确认灭菌柜中的温度分布符合设定的标准及确定最冷点位置等。常用的生物指示剂为枯草芽孢杆菌孢子（SporesofBacillussubtilis)。细菌内毒素灭活验证试验是证明除热原过程有效性的试验。一般将不小于1000单位的细菌内毒素加入待去热原的物品中，证明该去热原工艺能使内毒素至少下降3个对数单位。细菌内毒素灭活验证试验证专题-干热灭菌柜、湿热灭菌柜的验证策略（包含培养箱、隧道烘箱、稳定性试验箱、干燥烘箱）3/28验所用的细菌内毒素一般为大肠埃希菌内毒素（Escherichiacoliendoxin)。10.4生物指示剂D值：微生物的耐热参数，系指一定温度下，将微生物杀灭90%所需的时间，以分钟表示。生物指示剂中包含一定数量的一种或多种孢子，可制成多种形式。通常是将一定数量的孢子附着在惰性的载体上，如滤纸条、玻片、不锈钢、塑料制品等；孢子悬浮液也可密封于安瓿中；有的生物指示剂还配有培养基系统。常用生物指示剂：(1)湿热灭菌法湿热灭菌法最常用的生物指示剂为嗜热脂肪芽孢杆菌孢子（SporesofBacillusstearothermophilus,如NCTC10007、NCIMB8157、ATCC7953)。D值为1.5〜3.0min，每片（或每瓶）活孢子数5×105〜5×106个，在121°C、19min下应被完全杀灭。此外，还可使用生孢梭菌孢子（SporesofClostridiumsporogenes,如NCTC8594、NCIMB8053、ATCC7955),D值为0.4〜0.8min。(2)干热灭菌法干热灭菌法最常用的生物指示剂为枯草芽孢杆菌孢子（SporesofBacillussubtilis，如NCIMB8058、ATCC9372)。D值大于1.5min,每片活孢子数5×105〜5×106个。去热原验证时使用大肠埃希菌内毒素(Escherichiacoliendoxin)，加量不小于1000细菌内毒素单位。11、USP1211（药品生产验证指南2003版也提到）-针对干热灭菌，主要就是指隧道烘箱对于运行温度高于250℃的干热灭菌、除热原系统，其灭菌腔室内空载热分布的可接受的合格范围为±15℃。此试验应连续进行3次，以证明热分布的重现性，试验所采用的热电偶分布及全部试验数据的原始记录均应归档，必要时应附在验证报告中。注：①即所有温度均在平均值的±15℃内，且都不低于300℃。或者可以理解为灭菌段内所有点的温度数值均在设定温度±15℃内为合格。如我们的隧道烘箱，由于需要去除热原，所以采用的温度常常高于或等于300℃。因此，我们可以设置温度为320℃，标准即为305℃~335℃，实际验证中我们可以将范围在基础上再控制严格一点。个人建议方法使用①。②可以定义为是温度均匀度和温度波动度都满足要求。温度均匀度和温度波动度的定义出自：JJF1101-2003环境试验设备温度、湿度校准规范：主要是应用于常温常压设备，如培养箱、稳定性试验箱等。温度均匀度：在稳定状态下，在30min内（每2min测试一次）每次测试中实测最高温度与最低温度之差的算术平均值。温度波动度：在稳定状态下，工作空间中心点温度随时间的变化量，即中心点在30min内（每2min测试一次）实测最高温度与最低温度之差的一半。个人认为温度均匀度可以算灭菌段内（比如121℃30min，就是指30min）所有时间点所有温度数值的最高点和最低点的之差，这其实是严于上面算算术平均值的要求的。温度波动度不光应用于工作中心几何点，也可以用于所有其他点的温度波动。均匀度考察的是所有点，波动度考察的是单点在一段周期内的波动。个人建议方法使用①即可。12、JB/T20119-2009热风循环灭菌柜（适用于物品灭菌去热源的热风循环灭菌柜）12.1灭菌柜内腔的层流空气洁净度因为100级。验证专题-干热灭菌柜、湿热灭菌柜的验证策略（包含培养箱、隧道烘箱、稳定性试验箱、干燥烘箱）4/2812.2在灭菌过程中，当灭菌温度超过设定的灭菌温度时，应自动报警并停止加热；在灭菌过程中，当灭菌温度低于设定的灭菌温度5℃时，应自动报警并加热。12.3空载热分布温差应为±5℃。注：如灭菌温度为250℃，设定灭菌工艺参数：灭菌温度255℃，灭菌时间45min，30s打印一个温度数值。分析45min内12个探头的温度数值，取其平均值与记录的最高温度和最低温度进行比较，差值为高差值和低差值，即所有温度均在平均值的±5℃以内，且都不低于250℃。12.4满载热穿透性试验最冷点标准当量灭菌时间FH≥1365min。13、JB/T20033-2011热风循环烘箱（本标准适用于加热温度为60℃~140℃的热风循环烘箱，我们主要是要考虑到作为非灭菌烘干用的烘箱的使用。）-针对干热烘箱干燥13.1设定温度与实际温度的误差应为±1℃。注：设备控温探头应首先经过校准，可以进行拆卸校准，如果不能拆卸，则可采用探头旁放一经校准过的温度验证仪探头进行比对，确认设备显示的实际温度首先是准确的。然后再查看设备显示的实际温度的数值是否都在设定温度的±1℃内。13.2烘箱空载热分布应均匀，各测定点温度与腔室平均温度允许误差为±3℃。注：此标准是与平均值做比较，以平均值做为基准值，上下偏离3℃。即在升温完毕，进入烘干程序后，先计算每个温度探头在烘干阶段的平均值，然后计算各个点的平均值的均值，这个各个点的平均值的均值即腔室平均温度。再查看干燥程序内，所有点的温度数值均在腔室平均温度的上下偏差3℃内即为合格。这是考虑设备的性能，结合工艺干燥条件（假设某固体物料干燥温度为70℃±5℃），则干燥程序内所有温度均在65℃之上，75℃之下。或者说当干燥器具的时候，若假设使用100℃烘干，那设备空载在满足上述±3℃的条件下，还应当满足干燥程序最低温度大于等于100℃。14、EN285/GB8599（空载/标准负载）-针对湿热灭菌14.1温度控制要求1：灭菌温度范围下限为灭菌温度，上限应不超过灭菌温度+3℃。（2011GMP指南无菌药品P180也是引用此标准，工艺有特殊要求时除外）14.2温度控制要求2：灭菌维持阶段同一时刻最大温差不大于2°C。14.3时