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医疗器械检测微生物基础知识及操作品管部**前言微生物广泛存在于自然界中，可谓是到处有菌。在无菌医疗器械的生产过程中，由于医疗器械的多样性与复杂性，即使在标准制造状态下生产的产品，仍可能有微生物的污染。因此，了解和掌握微生物方面的有关知识，将有助于生产过程中微生物的控制和医疗用品质量的提高。第一节微生物及其种类一、微生物在自然界里，有许多肉眼看不到的、需用光学显微镜或电子显微镜才能观察到的微小生物，这类生物称为微生物。尽管微生物很小，但均有其一定的形态结构和生理功能，对外环境适应性极强，生长繁殖迅速，且广泛存在于空气、土壤、水及动植物的有机体中。第一节微生物及其种类二、微生物五大共性体积小，面积大；吸收多，转化快；生长旺，繁殖快；适应强，异变异；分布广，种类多。第一节微生物及其种类三、微生物的种类微生物的种类有10万种以上。按其结构、组成等差异，可分为3大类（一）非细胞型微生物体积微小，能通过滤菌器；只能在活细胞内生长繁殖。如病毒，就是形体最微小，结构最简单的微生物。（二）原核细胞型微生物仅有原始核，无核仁和核膜；缺乏完整的细胞器。这类微生物有细菌、衣原体、立克次体、螺旋体和放线菌。（三）真核细胞型微生物细胞核的分化程度较高，有核膜、核仁和染色体；胞浆内有完整的细胞器。真菌是真核型微生物。霉菌属此类型。第二节细菌的形态和基本结构一、细菌的形态与大小细菌在一定的条件下，可分为球菌、杆菌、弧菌或螺形菌，见图1。其体积微小，但大小不一。通常以μm作为测量单位。一般球菌的直径约为0.8～1.2μm，大球菌的直径可达2μm；杆菌长约2～3μm，宽0.3～0.5μm；螺形菌长1～50μm，宽0.3-1μm。能产生芽胞的菌比一般不产芽胞菌要大些。细菌以无性分裂方式繁殖，1个细菌分裂成2个细胞，2个细胞互相脱离为2个个体，再由2个分裂为4个，4个分裂成8个，如此连续不断裂殖。1个菌在十几分钟或1～2h就分裂1次。因此细菌接种在含有营养成分的固体培养基上，经过18～24h的生长繁殖，即有几十亿个菌云集在一起，出现称为肉眼可见的菌落群体（CFU）。第二节细菌的形态和基本结构图1各种细菌的形态1．葡萄球菌2．各种双球菌3．链球菌4．四联球菌5．八叠球菌6．球杆菌7．链杆菌8．弧菌9．螺形菌第二节细菌的形态和基本结构二、细菌的基本结构细菌虽小，但有一定构造。细胞壁、细胞膜、细胞质、核质等是各种各样细菌细胞均有的基本结构。而荚膜、鞭毛、芽胞、菌毛等仅某些细菌具有,是细菌的特殊结构。(一)细胞壁细胞壁位于菌体的最外层，是一层无色透明的薄膜，坚韧并富有弹性，其总量为细菌干重的10～25%。其功能是使细菌保持一定的外形，并起保护菌体的作用。它的化学组成主要是肽聚糖等蛋白质、类脂质和多糖等复合物。但随菌体不同而有差异。如大肠杆菌的细胞壁由类脂-蛋白质组成，金黄色葡萄球菌的细胞壁由甘油、磷酸、蛋白质组成。第二节细菌的形态和基本结构两类细胞壁的特征比较特征G+细菌G－细菌肽聚糖层厚层薄类脂极少脂多糖外膜缺有壁质间隙很薄较厚细胞状态僵硬僵硬或柔韧酸消化的效果原生质体原生质球对染料和抗生素的敏感性很敏感中度敏感第二节细菌的形态和基本结构第二节细菌的形态和基本结构(二)细胞膜细胞膜又称细胞质膜,位于胞壁之内，紧包于细胞质，它由双层磷脂和蛋白质镶嵌排列而成。其化学组成主要为脂类、蛋白质和核糖核酸。它具有半透性，与细胞壁一起维持细胞的通透性，具有物质转运与营养、调节菌体内外环境平衡的功能。(三)细胞质细胞质是细菌的基础物质，呈溶胶状态，为细菌进行新陈代谢的重要场所。基本成分为水(细菌质量70%是水)、蛋白质、核酸（核糖核酸及去氧核糖核酸）和脂类，也含有少量的糖和无机盐。并含有一系列的酶系统。进行合成、分解、氧化、还原反应，更新细胞内部结构和成分，维持菌体的生长、代谢等活动。第二节细菌的形态和基本结构(四)核质细菌的细胞核沒有核膜、核仁，沒有固定形态，这是原核生物和真核生物的主要区别。由于细菌的核比较原始,故一般细菌的核称原始形态的核戓称拟(类)核。细菌核物质的主要成分是脱氧核糖核酸(DNA),它实际上是与高等生物细胞核功能相似的核物质,故又称染色质体或细菌染色体,还有蛋白质、磷脂、糖元和酶类等。它控制着细菌的各种遗传性状，在繁殖活动中起着重要作用，细菌的裂殖，首先从细胞核开始，然后再形成细胞膜和细胞壁。第二节细菌的形态和基本结构(五)细胞壁外部结构有些细菌细胞壁外有多种结构，主要包括荚膜、菌毛、鞭毛和芽胞等，其功能主要是提供保护、黏附物体和细胞运动。在无菌医疗器械生产中具有意义的是芽胞结构。第二节细菌的形态和基本结构某些细菌，生长到一定时期或当外环境条件恶劣时，菌体失去大部分水分，细胞浆逐渐浓缩，形成圆形或椭圆形的特殊结构，称芽胞。芽胞可位于中央或末端，有的比菌体大，有的比菌体小，这些特征在产芽胞的菌中具有鉴别意义。第二节细菌的形态和基本结构第二节细菌的形态和基本结构因此，在日常的消毒灭菌中，均选择芽胞菌作为生物指示剂。如辐照灭菌中，选择短小杆菌芽胞；热力灭菌中，以嗜热脂肪杆菌芽胞作为判定灭菌效果的指标。第三节细菌的生长条件、代谢与营养一、细菌的生长条件(一)营养物质营养物质是细菌新陈代谢和生命活动的物质基础。细菌的营养物质主要有水、氮源、碳源、无机盐及生长因子等，细菌依靠这些物质合成菌体成分，获得所需能量及调节新陈代谢。细菌是单细胞生物，营养的摄取和吸收，主要依靠细胞膜的功能来完成。(二)酸碱度一般细菌的生长最适酸碱度(pH)为7.2～7.6，少数菌需在较酸或较碱的环境中生长繁殖。第三节细菌的生长条件、代谢与营养(三)温度温度是细菌生长的重要因素之一，各种细菌的适宜温度范围相差很大，据此而有嗜热(52℃)、嗜温及嗜冷菌之分。大多为嗜温菌(15～40℃)，一般细菌的培养采用37℃。各国药典规定需氧、厌氧菌30-35℃;霉菌20-25℃。我国药典2015版终于与国际接轨。(四)气体与细菌生长繁殖有关的气体主要有氧气和二氧化碳。第四节细菌的人工培养一、微生物的分离和纯培养了解了细菌生长的条件，即可采用人工的方法培养细菌，以利更好地研究、控制微生物。如车间内空气中微生物的测定，医疗用品初始污染菌的计数，生产人员手等卫生学调查以及制造环境的菌谱调查，即是利用细菌的生长条件和特性，进行的人工培养。微生物通常是肉眼看不到的微小生物，而且无处不在。因此，在微生物的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其他微生物污染的技术被称为无菌技术(aseptictechnique)它是保证微生物学研究正常进行的关键。第四节细菌的人工培养(一)培养方法细菌的培养只需提供充分的营养，合适的pH、温度和必要的气体环境，细菌即可生长繁殖。通常培养的方法是将细菌接种适当的培养基上，37℃温箱培养18～24h，即可用肉眼观察细菌生长的情况。用固体培养基分离纯培养1、稀释倒平板法(pourplatemethod)2、涂布平板法(spreadplatemethod)3、平板划线分离法(streakplatemethod)4、稀释摇管法(dilutlonshakeculturemethod)第四节细菌的人工培养(二)培养基按其用途可分为下列4大类。1、基础培养基：含细菌所需要的基本营养成分，可供多数细菌使用。主要有牛肉膏(0.3％)、蛋白胨(1％)、氯化钠(0.5％)、磷酸盐和水等配制而成，pH7.2～7.6，此为液体培养基。若加入凝固剂，如2～3％琼脂，使其固态化，即为固体培养基，细菌经接种后可形成肉眼可见的菌落。如营养琼脂培养基。若加0.1～0.5％琼脂，则为半固体培养基。常用于观察细菌动力或保存菌种；如普通肉汤半固体培养基。第四节细菌的人工培养2、营养培养基：在基础培养基中加入特殊营养物质，如血液、腹水、葡萄糖等，以供某些细菌的特殊营养要求。如血平板等。3、选择培养基：利用细菌对某类化学物质敏感性不同，选择性抑制某些细菌，而有利于欲选细菌的生长，从而达到分离的目的。如水质检查中的品红亚硫酸钠培养基，伊红美蓝培养基等。4、鉴别培养基：各细菌具不同的生化反应特性，可利用鉴别培养基加以区别，如糖发酵试验用的含糖含指示剂培养基，硫化氢生成试验用的醋酸铅培养基等。第四节细菌的人工培养按培养基状态可分为下列3类。1、固体培养基(solidmedium)在液体培养基中加入一定量凝固剂，使其成为固体状态即为固体培养基。固体培养基常用来进行微生物的分离、鉴定、活菌计数及菌种保藏等。2、半固体培养基(semisolidmedium)半固体培养基中凝固剂的含量比固体培养基少，培养基中琼脂含量一般为0.2%～0.7%。半固体培养基常用来观察微生物的运动特征、分类鉴定及噬菌体效价滴定等。3、液体培养基(liquidmedium)液体培养基中未加任何凝固剂。在用液体培养基培养微生物时，通过振荡或搅拌可以增加培养基的通气量，同时使营养物质分布均匀。液体培养基常用于大规模工业生产以及在实验室进行微生物的基础理论和应用方面的研究。第四节细菌的人工培养(三)细菌在培养基中的生长情况将细菌接种到液体培养基中，大多数的细菌生长呈现均匀浑浊的状态，少数呈链状的细菌可呈沉淀生长，专性需氧菌多生长在液体表面，形成菌膜。在半固体培养基上，无动力(无鞭毛)的细菌可沿穿刺线生长，呈明显的线形，周围培养基仍透明澄清。有鞭毛的细菌可向穿刺线四周运动弥散，呈羽状或云雾状浑浊生长，穿刺线模糊不清。故半固体培养基可用于检查细菌有无动力。第四节细菌的人工培养单个细菌（或其他微生物）细胞或一堆同种细胞在适宜固体培养基表面或内部生长繁殖到一定程度，形成肉眼可见的子细胞群落，我们称之为菌落。一般情况下，1个菌落由1个单独细菌经不断分裂繁殖堆积而成，故1个菌落属1个细菌的后代，是纯种。由于细菌种类、菌龄以及培养基的成分等因素的不同，菌落的形态、大小、色泽也不一样。因此，菌落的形态特征是识别各种细菌的主要依据之一。另外，根据培养基上菌落的数目，也可计算样品(水、物体表面、空气等)中的活细菌数（cfu/mL）。菌落形成单位（CFU，Colony-FormingUnits）指单位体积中的细菌群落种数。第四节细菌的人工培养第四节细菌的人工培养第四节细菌形态的检查根据细菌形态、结构和染色反应性可大致决定其种属，因此，细菌形态学检查是细菌分类和鉴定的基础。如革兰染色后，可分辨出细菌是革兰阳性菌还是阴性菌，是球菌还是杆菌，能否形成芽胞(因芽胞壁厚、折光性强、不易着色等，故可在显微镜下加以识别)。所以，此法可协助查明车间、医疗用品及各种操作环节的常见污染菌。如污染了形成芽胞的细菌，由于该型菌类抵抗力强，必须采用灭菌剂进行灭菌处理。稀释度选择及菌落总数报告方式10-110-210-3两稀释度之比总数报告方式1136516420—1640016000or1.6×10422760295461.63775038000or3.8×10432890271602.22710027000or2.7×1044无法计数4650513—5130051000or5.1×104527115—270270or2.7×1026无法计数30512—3050031000or3.1×104第四节细菌形态的检查一、检查工具——显微镜一般形态学检查中，最常用的是显微镜。它是采用自然光或灯光为光源，其波长0.4µm，在最佳的条件下，显微镜分辨率为波长的一半，即为0.2µm。而肉眼所能看到的最小影像为0.2mm。故在普通显微镜下用油镜放大1000倍，可将0.2µm的微粒放大成0.2mm，能使人眼所见。一般细菌都大于0.2µm，在普通显微镜下均可清楚看到。为提高观察效果，观察更小的微生物，还可用暗视野显微镜、荧光显微镜及电子显微镜等。第四节细菌形态的检查二、不染色标本的检查为观察生活状态下细菌的形态及运动情况，可直接采用不染色标本。一般常用悬滴法(将涂有标本凹玻片