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细胞治疗及干细胞库发展现状实验室产品集团赛默飞世尔中国8008105118，4006505118://的产品和服务电子商务客户服务配送现场服务试剂仪器设备耗材软件Products3ThermoFisher在中国•ThermoFisher全球•100余亿美元年营收•40个国家35,000多名员工•150个国家350,000多个客户•美国财富234位•ThermoFisher中国•1,400名员工•6个生产工厂•2个物流中心•7个销售办公中心•2个客户体验中心（上海、北京）•1个技术研发中心•ThermoFisher重点产品线•科学仪器•过程仪器•环境仪器•生命科学试剂•实验室产品•专业诊断2005201020062007200820091020名员工1116名员工1404名员工2004262名员工467名员工554名员工907名员工广州香港成都上海北京东莞兰州沈阳济南武汉销售/办公中心销售/办公中心/工厂/客户体验中心4LEDLCDLSPLHSP&ALPGCCSThermo实验室产品部主要产品线RevcoFormaSorvallHeraeusBID5细胞治疗：细胞水平的再生医学再生医学组织水平(组织工程)利用细胞和支架体外构建组织移植入受损的组织和器官组织/器官功能修复细胞水平(细胞治疗)干细胞治疗间充质干细胞移植组织/细胞功能修复免疫细胞治疗免疫功能增强蛋白质水平(生物大分子药筛)通过比较健康个体和疾病个体的基因图谱识别异常基因对异常基因测序、表达并将对应蛋白或该蛋白的抗体引入疾病个体内该异常蛋白在体内对应的功能得到修复或纠正个体水平(克隆)iPS/hES细胞移植入囊胚体细胞核移植入去核卵细胞胚胎再造个体克隆间充质干细胞提取间充质干细胞扩增间充质干细胞鉴定造血干细胞移植造血干细胞提取造血干细胞鉴定DC/CIK回输DC/CIK提取DC/CIK扩增/(强化)DC/CIK鉴定6细胞治疗和干细胞库存现状•发展阶段：•09年被划归三类医疗技术管理后，细胞治疗目前处于一个爆发式的增长阶段。•干细胞治疗•中国在干细胞的临床应用上目前处于较为领先水平。•主要使用脐带间充质干细胞治疗:4000-5000例/年，~RMB50,000-200,000/病例。•脐血/骨髓/宫内膜间充质干细胞治疗+其它干细胞治疗:1000-2000例/年，～RMB40,000-100,000/病例。•免疫细胞治疗•肿瘤和乙肝是目前免疫细胞治疗的重点。•目前主要使用DC和CIK，每年大约50,000-60,000病人接受免疫细胞治疗，收费30,000-50,000人民币/病例。•干细胞库•脐血造血干细胞（入库30万人份）：自体脐血造血干细胞临床应用进展•脐带间充值干细胞（入库8万人份）：保留个体发育早期的干细胞用于成年后组织修复•宫内膜间充质干细胞，起步阶段•骨髓间充值、脂肪间充值等其它干细胞类型•中国巨大的发展潜力：30000RMB/新生儿x1500万新生儿/年7细胞治疗和干细胞建库模式间充质干细胞治疗免疫细胞治疗干细胞建库（间充质干细胞和造血干细胞）组织采集(脐带/脐血/骨髓等)干细胞提取干细胞移植干细胞储存/运输干细胞扩增干细胞鉴定医院商业实验室或医院生物治疗中心医院造血干细胞富集脐血采集富集血样的长期冻存富集后血样的鉴定组织采集间充质干细胞提取间充质干细胞长期冻存间充质干细胞扩增间充质干细胞鉴定血样采集免疫细胞提取免疫细胞回输免疫细胞鉴定免疫细胞扩增免疫细胞强化医院（生物治疗中心/肿瘤科/血液科）搜集组织的医院脐血库或商业干细胞库实验室脐血库或商业干细胞库搜集组织的医院脐血库脐血库8细胞治疗在肿瘤治疗中的应用参考解放军309医院国际肿瘤治疗中心（）等多处资料免疫因子重组抗体基因疗法细胞治疗放疗生物治疗化疗手术肿瘤综合治疗LAK/TIL/CD3AK/CTL：自上世纪80年代以来先后应用于临床的字体免疫细胞，但由于存在着扩增倍速较低、细胞来源困难、细胞毒力不高等诸多问题，该疗法在临床应用上受到一定限制。细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-inducedkillercell,CIK）1.1991年发现的，以共同表达CD3和CD56为特征；2.增值速度快。经过2－3周左右的体外培养，细胞数量可增加400倍以上，占总细胞的比例可达40%以上。3.杀瘤活性高：杀伤单位（TLU）为LAK细胞的73倍以上。4.杀瘤谱广：CIK细胞虽然以CD3、CD56细胞为主要效应细胞，却没有T淋巴细胞杀伤时的MHC限制性。5.体外培养依赖CD3单抗和IFN-γ。CD3单抗可作为丝裂原活性单位与T细胞表面的CD3交联，诱导其活化，而IFN-γ则诱导IL-1等细胞因子的合成。自体免疫细胞治疗原理是从患者自体外周血中分离的单个核细胞经过体外激活和扩增后输入患者体内，直接杀伤肿瘤细胞或病毒感染细胞，或调节和增强机体的免疫功能的一种新的肿瘤治疗技术。树突状细胞(dendriticcell，DC)是最有效的抗原递呈细胞。DC的目标在于诱导肿瘤特异性和长期持久的免疫反应，这种效应有助于防止微小残留病灶和肿瘤复发。毒副作用1)细胞制剂中的某些成分(如IL-2、IFN-7)或残留可引起寒战、发热、肌痛等感冒症状或胃肠道反应，大部分症状轻微而且可以自行缓解，但仍需引起临床足够重视。2)大剂量静脉输入细胞可能造成细胞滞留某系脏器（如肺部），其影响有待进一步研究。主要禁忌1)DC/CIK不宜与化疗放疗同时应用以防化疗放疗杀伤输入的细胞，CIK细胞对化疗尤为敏感；2)对本治疗中所用生物制剂（如IL-2、IFN-7）过敏患者不宜使用免疫细胞治疗。适应情形1)减少恶性肿瘤传统治疗后的复发与转移；2)提高肿瘤综合治疗疗效；3)少数肿瘤及患者的主要治疗手段（对放化疗不敏感或者无法耐受的情况以及对免疫原性较强的的肿瘤）。经基因改变的自体T细胞：自体T细胞体外经慢病毒转染表达识别CD19的嵌合受体，该受体识别表达CD19的CLL肿瘤细胞后杀伤肿瘤细胞，这一基因改变的细胞在回输后在体内增值1000倍以上。9DC/CIK在肿瘤治疗中的典型应用自体免疫细胞治疗技术流程图常见治疗流程举例•诱导：患者采血前注射GM-CSF或IL23-5天•采血：使用血细胞分离机从循环血液中采集富含单核细胞的血样（～109单核细胞）•细胞分离：离心收获单核细胞，用贴壁方法分离DC和CIK•扩增与诱导：1）DC在扩增中使用因子诱导，之后负载抗原，用肿瘤抗原刺激提高DC对特定肿瘤细胞的识别能力。2）CIK在扩增中使用因子诱导，之后可与DC共培养•细胞质检：对制备后的细胞做活性、标志物及常规微生物检验•细胞回输：讲细胞洗涤并在悬浮液中添加白蛋白、IL2等因子，一个疗程内分若干次回输患者体内(DC:~107-8/注射；CIK:~108-9/注射)•疗效评估：在每一个疗程后按照疗效指标，对患者的治疗效果进行评估。自体细胞免疫治疗技术示意图共培养GM-CSF/IL4等GM-CSF/IL2诱导肿瘤细胞碎片://基础上修改10临床应用的干细胞类型及来源干细胞临床应用监管原则作为药品：需使用胚胎干细胞或混合不同人来源的细胞，以完成大量临床试验以及制药过程中大规模细胞生产作为医疗技术：可以使用原代或有限传代的细胞做个性化治疗•胎儿间充值干细胞（需要冻存自体胎儿期细胞或者异体移植）•脐带间充值干细胞•脐带血间充值干细胞•胎盘间充值干细胞•成体间充值干细胞（可使用自体成体细胞）•脂肪间充值干细胞•宫内膜间充值干细胞•骨髓间充质干细胞Pappa,2009Cao,200911脐带间充值干细胞特点•易于获取组织来源充沛；原代细胞数目多(1-2x106)；从组织提取细胞较为方便；•易于稳定扩增增值潜力大，可穿代次数多；扩增过程中性能较为稳定；扩增过程中不易衰老；适应性强，培养条件简单；•分泌细胞因子能力强•分化阶段较早•无明显免疫原性，却有免疫调节功能ESC（high）UCMSC（medium）BMMSC（low）ComparisonofexpressionlevelsofmultipotentmarkergenesBasalmediaSerumGrowthfactorsOthers56%DMEM-LG+37%MCBD2012%FBS1ng/mlEGF10ng/mlPDGF/BB1xAMBUMax110nMDXM50uMAA-2P85%αMEM15%humanserum95%DMEM-LG5%FBS10ng/mlVEGF10ng/mlEGF2mMglutamine80%DMEM20%FBS45%α-MEM+45%F-1210%FBS90%DMEM-LG10%FBS5ng/mlbFGF5ng/mlEGF85%DMEM-LG10%FBS+5%horseserumPappa2009;Troyer2009；Lu2006;Karahuseyinoglu2007；Jo2008；Weiss2006;Majore2009;Lu2006;Mitchel2003;Periera2008;Periera2008;Petsa2009;Qiao2008；Seshareddy2008；Friedman2007；Nekanti200912干细胞治疗适用症、机理及临床细胞使用方法•适用情形•器官组织功能衰退性疾病:如帕金森综合征、晚期肝脏疾病•自体免疫性疾病:如牛皮癣，系统性红斑狼疮•组织物理损伤：如皮肤烧伤，关节软骨磨损•禁忌症：•恶性肿瘤•可能的疗效机理•细胞因子分泌•分化•免疫调节•细胞迁徙•临床细胞使用方法•引入方法•局部引入：介入移植•系统引入：静脉滴注•干细胞分化状态:预分化/未分化•条件培养基13临床用细胞制备过程中安全性基本考虑•对接受治疗的患者的保护•减少外源微生物感染细胞的可能性（支原体、细菌等）•提高细胞的生物活性•降低细胞培养液中的残留物质，避免发烧、严重过敏等不良反应•对其它患者、操作者及环境的保护•降低患者传染性的样本之间交叉感染的几率•减少患者具有传染性的细胞和组织样本对环境和操作者的潜在威胁14细胞治疗中一些需要进一步完善的地方•细胞制备规范性：操作、设备耗材、试剂•操作：•不同个体来源的细胞混合培养•细胞传代次数过多•细胞活性检测仅使用胎盘蓝而未进一步检测凋亡•细胞生长密度过大•细胞冻存方法不规范•设备与耗材•使用超净台培养病人细胞•细胞培养重复使用移液管、培养瓶、离心管等一次性耗材•冻存管液氮储存的样品交叉感染•培养病人细胞的培养箱不及时灭菌•试剂•培养基体系尚未完善和标准化•无血清培养与血清替代品的选择•血清选择使用不够严格•干细胞冻存过程中血清浓度过高•细胞临床应用方案•针对不同疾病和脏器的细胞移植方案的研究开发•对潜在不良反应的进一步防范•与其他疗法的配伍•复苏后的细胞不经培养立即注射•治疗机理的进一步研究•治疗机理的深入研究•细胞制剂的开发15干细胞/组织样本库：样本种类及冷冻技术•样本种类•提纯的生物大分子•细胞悬浮液•片状组织及颗粒状组织小块•大块组织或器官•样本内保护的对象•生物大分子•活细胞•活组织微观结构•冷冻伤害•冰晶损伤(intracellularicedamage):：冷冻速度过形成快较多冰晶，直接伤害细胞和组织微观结构•溶液损伤(solutiondamage):：冷冻速度过慢引起，细胞内外溶液由于部分水形成冰晶而造成生物液体渗透压升高•冷冻技术•程序降温(programmedfreezing)/分步降温(stepwisefreezing)：细胞和薄片状组织和器官•玻璃化冷冻(vitrificat