5、-相对定量：-ΔΔCT法和相对标准曲线法

Module5相对定量：ΔΔCT法和相对标准曲线法2相对定量PCR:相对基因表达量3目的基因：Plat1未处理样本处理后样本示例实验问题:样本处理后，目的基因的表达量有什么变化?4DRnCyclesCt=23Ct=24DCt=24–23=1未处理组：目的基因处理组：目的基因目的基因与目的基因的比较5DRnCycles未处理组：目的基因和内参基因处理组：目的基因和内参基因如果加入内参基因会怎样呢?DCt=23–13=10Ct=24Ct=14Ct=13Ct=23DCt=24–14=106两种相对定量的方法比较Ct(ΔΔCt)法相对标准曲线法样本间的倍数关系7两种方法的区别?•已知各个基因的扩增效率•不需要每次都做标准曲线•简单,经济,通量较高•每个基因都要做一条标准曲线•准确的扩增效率计算•工作量大,成本高,通量较低比较Ct(ΔΔCt)法相对标准曲线法8如何选择相对定量的方法？[Template]Ct目的基因内参基因ABCDEFGHIJ对应点相减A-F=ΔCt19|LifeTechnologiesProprietary&Confidential|6/7/2013[Template]Ct目的基因内参基因ABCDEFGHIJ对应点相减如何选择相对定量的方法？A-F=ΔCt1B-G=ΔCt2C-H=ΔCt3D-I=ΔCt4E-J=ΔCt510在Excel中制作图表ΔCt1ΔCt2ΔCt3ΔCt4ΔCt5A-F=ΔCt1B-G=ΔCt2C-H=ΔCt3D-I=ΔCt4E-J=ΔCt5ΔCt稀释点12345如何选择相对定量的方法？11根据斜率选择一种定量方法比较Ct(ΔΔCt)法︱斜率︱≤0.1相对标准曲线法︱斜率︱≥0.1如何选择相对定量的方法？12ΔΔCt法|LifeTechnologiesProprietary&Confidential|6/7/201313ΔΔCt法的必要条件两个基因(目的基因和内参基因)必须有相一致的扩增效率，并尽可能接近100%!14|LifeTechnologiesProprietary&Confidential|6/7/2013ΔΔCt法如何确认扩增效率每对引物一条标准曲线15标准曲线可以帮助判断扩增效率•斜率-3.3说明扩增效率接近100%.公式:E=10(-1/斜率)-116ΔΔCt法如何判断扩增效率一致同时扩增目的基因和内参基因，通过查看扩增曲线中指数增长期是否平行来确定扩增效率是否相似。17检查指数增长期的曲线之间是否平行内参基因目的基因19•后续实验中采用ΔΔCt法.21ΔΔCt反应板设置对未知样本的目的基因和内参基因进行定量(每个样本三个重复)无模板对照(NTCs)–污染监测22ΔΔCt法结果计算步骤2:其他样本和对照样本比较DCt处理样本–DCt对照样本=DDCt步骤1:内参基因均一化样本差异Ct目的基因–Ct内参基因=DCt步骤3:使用公式计算2-DDCt倍数变化=23为什么Ct值要相减而不是相除?•Ct值是指数值,而不是线性值.•因此,我们不能直接用Ct值相除.•用相减来比较Ct值.(例如:225÷220=25)24公式含义?2CT2=循环间扩增产物量的倍数变化(i.e.PCR扩增产物量倍增)DDCT=校正过的处理样本和校正过的对照样本之间的循环数差异所以，这个公式告诉我们对照样本和处理样本之间目的基因的倍数变化25ΔΔCt计算示例UntreatedTreated2Treated1Cttarg.Ctnorm.dCtddCt2(-ddCt)26.116.79.40123.816.07.8-1.6322.817.75.1-4.320显示出两倍的表达差异.重复样本平均Ct值26UntreatedTreated2Treated1Cttarg.Ctnorm.dCtddCt2(-ddCt)26.116.79.40123.816.07.8-1.6322.817.75.1-4.320为了去除样本间加样量不同带来的误差，需要对数据均一化处理ΔΔCt计算示例Ct目的基因–Ct内参基因=ΔCt27UntreatedTreated2Treated1Cttarg.Ctnorm.ΔCtddCt2(-ddCt)26.116.79.40123.816.07.8-1.6322.817.75.1-4.320Ct目的基因–Ct内参基因=ΔCt为了去除样本间加样量不同带来的误差，需要对数据均一化处理ΔΔCt计算示例28选择一个对照样本UntreatedTreated2Treated1Cttarg.Ctnorm.ΔCtΔΔCt2(-ddCt)26.116.79.40123.816.07.8-1.6322.817.75.1-4.32029选择一个对照样本UntreatedTreated2Treated1Cttarg.Ctnorm.ΔCtΔΔCt2(-ddCt)26.116.79.40123.816.07.8-1.6322.817.75.1-4.320ΔCt处理样本–ΔCt对照样本=ΔΔCt首先,均一化对照样本(如：对照样本–对照样本).接着,所有样本和对照样本进行比较(未知样本–对照样本).30选择一个对照样本UntreatedTreated2Treated1Cttarg.Ctnorm.ΔCtΔΔCt2(-ddCt)26.116.79.40123.816.07.8-1.6322.817.75.1-4.320ΔCt处理样本–ΔCt对照样本=ΔΔCt首先,均一化对照样本(如：对照样本–对照样本).接着,所有样本和对照样本进行比较(未知样本–对照样本).31ΔΔCt倍数计算UntreatedTreated2Treated1Cttarg.Ctnorm.ΔCtΔΔCt2(-ΔΔCt)26.116.79.40123.816.07.8-1.6322.817.75.1-4.320最后计算出倍数关系:倍数变化=2-ΔΔCt32ΔΔCt倍数计算UntreatedTreated2Treated1Cttarg.Ctnorm.ΔCtΔΔCt2(-ΔΔCt)26.116.79.40123.816.07.8-1.6322.817.75.1-4.320相对定量(RQ)值最后计算出倍数关系:倍数变化=2-ΔΔCt33对照样本实验流程t=0t=12t=24t=48timetotalRNAcDNAtotalRNAcDNAtotalRNAcDNAtotalRNAcDNA目的基因内参基因34•我们来算一下基因表达变化DRnCyclesCt=22Ct=27t=12hDRnCyclesCt=24Ct=26t=24hDRnCyclesCt=23Ct=33t=48hDRnCyclesCt=23Ct=30t=0内参基因目的基因35SampleCtPlat1AverageCtCtGAPDHAverageCtΔCtPlat1Ct－GAPDHCtΔΔCtΔCttreated－ΔCtuntreatedFolddifferenceinPlat1relativetountreatedTime=0hr30.4923.636.860.001.0Time=12hr27.0322.664.37-2.505.6Time=24hr27.0623.20Time=48hr32.8323.013.869.82-3.002.968.00.13相对定量结果计算36123455.68.01t=0t=12ht=24ht=48h0.13Calibratort=0相对定量结果678GeneExpression37软件计算为你完成所有的计算!38相对标准曲线法39应该稀释什么样品来制作标准曲线?•任何数量充足，并表达目的基因和内参基因的浓度较高cDNA•只需知道稀释倍数,不需要知道浓度•养成好的制作标准曲线的习惯40每对引物做一条标准曲线18sInsulin10,000100010010110,00010001001016420.64171.4CtRelativeQuantityCtRelativeQuantityUntreatedCtTreatedCtUntreatedCt74.6TreatedCt202.341计算举例UntreatedQavg.TreatedQavg.Insulin18s74.6202.36420.64171.4÷÷NormalizedQ0.01160.0484选择一个对照样本：例如,UntreatedUntreated÷Untreated:0.0116÷0.0116=1Treated÷Untreated:0.0484÷0.0116=4.2表达倍数差异42软件计算为你计算好所有的倍数关系43Question?