慢病毒包装手册2009

慢病毒包装手册200年月地址：北京市海淀区温泉路45号电话：邮编：传真：网址：LQRYRJHQFRPEmail：RUGHU#LQRYRJHQFRP2目录慢病毒系统简介…………………………………………………………………………………3实验流程描述……………………………………………………………………………………5实验材料…………………………………………………………………………………………6病毒包装细胞293T的培养…………………………………………………………………7Lentivirus病毒包装……………………………………………………………………………8病毒的收获及浓缩……………………………………………………………………………9Lentivirus滴度测定…………………………………………………………………………111)孔稀释法测定滴度…………………………………………………………………………112)Realtime定量PCR法测定滴度…………………………………………………………14示例:Real-time定量PCR法测定GFP-tagged慢病毒……………………………………17参考文献………………………………………………………………………………………203慢病毒系统简介慢病毒（Lentivirus）载体是以人类免疫缺陷型病毒（HIV）为基础发展起来的基因治疗载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，并可以在体内较长期的表达且安全性高。英茂盛业提供的Lentivirus为“自杀”性病毒，即病毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。Lentivirus中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。但该病毒仍然具有可能的潜在的生物学危险，英茂盛业建议不要使用编码已知或可能会致癌的基因的假型病毒，除非已经完全公认某个基因肯定没有致癌性，否则均不建议采用假型病毒进行生物学实验。英茂盛业慢病毒载体系统由pLV穿梭载体、pHelper1.0载体和pHelper2.0载体三质粒组成。pGC-LV载体中含有HIV的基本元件5’LTR和3’LTR以及其他辅助元件，例如WRE(woodchuckhepatitisvirusposttranscriptionalregulatoryelement)。通常根据不同的实验目的针对pGC-LV载体改造以进行启动子活性研究、基因表达研究、RNA干扰等研究。pHelper1.0载体中含有HIV病毒的gag基因，编码病毒主要的结构蛋白；pol基因，编码病毒特异性的酶；rev基因，编码调节gag和pol基因表达的调节因子。pHelper2.0载体中含有单纯疱疹病毒来源的VSV-G基因，提供病毒包装所需要的包膜蛋白。英茂盛业慢病毒载体图谱：1)pLV载体图谱：以上载体为用于RNA干扰的pLV穿梭载体，带有GFP标记。用于其他研究的pLV载体的框架与此基本相同。[具体结构请参考克隆构建部分]地址：北京市海淀区温泉路45号电话：邮编：传真：网址：LQRYRJHQFRPEmail：RUGHU#LQRYRJHQFRP42)pHelper1.0载体图谱：3)pHelper2.0载体图谱：地址：北京市海淀区温泉路45号电话：邮编：传真：网址：LQRYRJHQFRPEmail：RUGHU#LQRYRJHQFRP5实验流程描述制备编码慢病毒颗粒的重组病毒质粒及其两种辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，按Invitrogen公司Lipofectamine2000使用说明进行共转染293T细胞，转染后8h更换为完全培养基，培养48h后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液，在293T细胞中测定并标定病毒滴度。在一定滴度范围内的慢病毒颗粒可以满足大部分体内体外实验需求。慢病毒包装流程图：地址：北京市海淀区温泉路45号电话：邮编：传真：网址：LQRYRJHQFRPEmail：RUGHU#LQRYRJHQFRP6实验材料细胞株293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10%FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。菌株大肠杆菌菌株DH5α。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。病毒载体a)pLV重组载体；b)pHelper1.0；c)pHelper2.0DNA溶液的制备：以Qiagen公司的质粒抽提试剂盒提取慢病毒包装系统中三种质粒DNA，质粒DNA溶于除菌的TE中，以紫外光吸收法测定其浓度及纯度，保证所提质粒DNA的A260/A280在1.8～2.0之间。试剂试剂名称试剂来源cat.No.台盼兰上海捷倍思基因技术有限公司胎牛血清FBS上海微科生化试剂有限公司A11-102DMSO上海生物试剂厂DMEMGIBCO12800-017胰酶上海化学试剂公司Lipofectamine2000Invitrogen11668-500仪器仪器名称仪器来源cat.No.荧光显微镜奥林帕斯micropublisher3.3RTVCO2培养箱日本三洋SANYOMCO-175生物安全柜上海振样创空气净化设备有限公司Bio1200-Ⅱ-A2Plus-20离心超滤装置MILLIPOREufc910024地址：北京市海淀区温泉路45号电话：邮编：传真：网址：LQRYRJHQFRPEmail：RUGHU#LQRYRJHQFRP7病毒包装细胞293T的培养活细胞计数用无血清培养基把细胞悬液稀释到200～2000个/ml(一般稀释倍数为100倍)，在0.1ml的细胞悬液中加入0.1ml的0.4%的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色的细胞是死细胞。细胞株的冻存1．取培养2～3天生长旺盛的细胞，用细胞培养液将细胞配成2×106～2×107/ml。2．在1ml细胞冻存管中加入0.5ml细胞悬液，0.4ml小牛血清和0.1ml二甲基亚砜(或甘油)，混匀后密封。置4℃1小时，-20℃2小时，然后直接放入液氮中或置液氮蒸汽上过夜后浸入液氮中。细胞复苏1．从液氮罐中取出细胞冻存管，应带有防护眼睛和手套。2．迅速放入盛有37℃水的水浴中，并不时摇动，尽快解冻。3．用70%酒精擦拭消毒后，移至净化台上，吸出细胞悬液至培养瓶中，补加3ml含10%FBS的DMEM培养基，置温箱培养。4．次日更换一次培养液后再继续培养。细胞传代1．弃去旧培养液，加入5ml灭菌PBS溶液，轻轻晃动，洗涤细胞生长面，然后弃去PBS溶液。2．加入2ml胰酶消化液，消化1-2min直到细胞完全消化下来。3．加入含10%胎牛血清和100U/ml双抗的DMEM培养基5ml，用刻度吸管吹打数次，将瓶壁上的细胞冲洗下来。4．混匀细胞后分至两个新的培养瓶中，继续培养。地址：北京市海淀区温泉路45号电话：邮编：传真：网址：LQRYRJHQFRPEmail：RUGHU#LQRYRJHQFRP地址：北京市海淀区温泉路45号电话：邮编：传真：网址：LQRYRJHQFRPEmail：RUGHU#LQRYRJHQFRP8Lentivirus病毒包装细胞转染1)转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，以含10%血清的培养基调整细胞密度为1.2x107细胞/20ml，重新接种于15cm细胞培养皿，37℃、5%CO2培养箱内培养。24h待细胞密度达70%～80%时即可用于转染。细胞状态对于病毒包装至关重要，因此需要保证良好的细胞状态和较少的传代次数。2)转染前2h将细胞培养基更换为无血清培养基。3)向一灭菌离心管中加入所制备的各DNA溶液(pGC-LV载体20μg，pHelper1.0载体15μg，pHelper2.0载体10μg)，与相应体积的Opti-MEM混合均匀，调整总体积为2.5ml，在室温下温育5分钟。4)将Lipofectamine2000试剂轻柔摇匀，取100μlLipofectamine2000试剂在另一管中与2.4mlOpti-MEM混合，在室温下温育5分钟。5)把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine2000进行混合，轻轻地颠倒混匀，不要振荡。必须在5分钟之内混合。6)混合后，在室温下温育20分钟，以便形成DNA与Lipofectamine2000稀释液的转染复合物。7)将DNA与Lipofectamine2000混合液转移至293T细胞的培养液中，混匀，于37℃,5%CO2细胞培养箱中培养。8)培养8h后倒去含有转染混和物的培养基，每瓶细胞加入20ml的PBS液，10)轻轻左右晃动一下培养瓶以洗涤残余的转染混和物，然后倒去。9)每瓶细胞中加入含10%血清的细胞培养基25ml，于37℃、5%CO2培养箱内继续培养48小时。9病毒的收获及浓缩1．收集转染后48小时（转染即可为0小时计起）的293T细胞上清液。2．于4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片。3．以0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中。4．把病毒粗提液样品加入到过滤杯中（最多19ml），盖上盖子。将过滤杯插到滤过液收集管中。5．组合好后，做好平衡，放在转头上。6．在4000×g离心，至需要的病毒浓缩体积。通常需要的时间为10-15分钟。7．离心结束后，取出离心装置，将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开。8．将过滤杯倒扣在样品收集杯上。9．离心力不超过1000g,时间为2分钟。过高转速会导致样品损失。把离心杯从样品收集杯上移开。样品收集杯中的即为病毒浓缩液。地址：北京市海淀区温泉路45号电话：邮编：传真：网址：LQRYRJHQFRPEmail：RUGHU#LQRYRJHQFRP1010．将病毒浓缩液移出，分装后保存在病毒管中，-80度长期保存。取其中一支进行病毒生物学滴度测定。[详情登陆网站，查看CentriconPlus-20，P31925信息]地址：北京市海淀区温泉路45号电话：邮编：传真：网址：LQRYRJHQFRPEmail：RUGHU#LQRYRJHQFRP11Lentivirus滴度测定1)孔稀释法测定滴度1．测定前一天，为测定滴度所需的细胞（英茂盛业公司用的293T细胞：贴壁生长）铺板，96孔板，每个孔加4×104个细胞，体积为100μl。2．根据病毒的预期滴度，准备7~10个无菌的Ep管。在每个管中加入90μl的无血清培养基。3．取待测定的病毒原液10μl加入到第一个管中，混匀后，取10μl加入到第二个管中。继续相同的操作直到最后一管。4．选取所需的细胞孔，吸去90μl培养基，丢弃。加入90μl稀释好的病毒溶液。放入培养箱培养。5．24小时后，加入完全培养基100μl。小心操作，不要吹起细胞。6．4天后，观察荧光表达情况。荧光细胞数随稀释倍数的增加而减少。说明：第一个Ep管中加入10ul病毒原液，记为1E+1μl；第二个Ep管中进行了第一次十倍稀释，所得病毒原液为第一个Ep中的1/10，记为1E+0μl；第三个Ep管中进行了第二次十倍稀释，所得病毒原液为第二个Ep中的1/10，记为1E-1μl；依次类推…第七个E