外显子捕获具体步骤以及各试剂的作用

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外显子捕获余晗20171201外显子是真核生物基因的一部分,它在剪接后仍会被保存下来,并可在蛋白质生物合成过程中被表达为蛋白质。在人类基因中大约有180,000个外显子,占人类基因组的1%,约30MB。人类基因组的蛋白编码区域大约包含85%的致病突变。外显子测序是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。是一种选择基因组的编码序列的高效策略,外显子测序相对于基因组重测序成本较低,对研究已知基因的SNP、Indel等具有较大的优势。对肿瘤基因突变检测具有显著意义,因为外显子测序容易提高深度,可以轻易达到100X、200X。而因为外显子捕获是有偶然性的,对小片段结构变异、拷贝数变异很难检测。外显子测序简介外显子组包含合成蛋白质所需要的重要信息序列。外显子序列捕获芯片(或溶液)可在同一张芯片上以高特异性和高覆盖率捕获研究者感兴趣的目标外显子区域,后续测序直接解析数据。背景介绍发现外显子区的绝大部分的疾病相关变异可发现常见变异和频率5%低频突变只对基因组的约1%测序,更加经济、高效人的全基因是3G,如果要把全基因都测一下,一般要平均30x的覆盖。也就是要90G的数据。这样的测序量,成本大约是一个样本6万多元。如果样本多的话,费用上可能负担不起。而外显子只占人全部基因序列的1%,而且是最关键的1%。把外显子全都测了,就相当于抓住了问题的主要矛盾。同时测序量大大降低。这就是用外显子测序来替代全基因重测序的第一个原因。在相同预算情况下,可提供更高深度测序第二个原因是在做肿瘤测序的时候,肿瘤本身存在着较大异质性。肿瘤的基因序列是不稳定的,一直在变的,也就是肿瘤的深部、浅部可能其基因序是不一样的。为了测出各种突变,就需要有较深的测序重度,比如100x、甚至200x的测序深度。这时候外显子测序就可以做到高的测序覆盖度,同时费用不会太高。技术优势劣势:外显子测序是全基因重测序的一个较为经济的替代手段,对研究基因的SNP、Indel等具有较大的优势,但无法研究基因组结构变异如染色体断裂重组等,一般在疾病研究中,会结合转录组测序一起研究。目前市场主要外显子捕获试剂盒SeqCapEZHumanExomeLibraryv3.0(Roche)SureSelectXTHumanAllExonV6(Agilent)TruSeqExomeLibraryPrepKit(Illumina)TruSeqRapidExomeLibraryPrepKit(Illumina)四种测序试剂盒比较Nimblegen和Illumina的捕获试剂盒中的探针是DNA探针,化学性质稳;Agilent的捕获试剂盒是RNA探针,有可能RNA不是很稳定。Roche罗氏2008年推出NimbleGen序列捕获2.1M外显子组芯片,随之在2009年底推出的EZ外显子组序列捕获能提供液相的工作流程并以DNA液相探针杂交来捕获目的片段。SeqCapEZHumanExomeLibrary使用高密度探针的方法,主要是利用杂交和DNA微阵列技术基因分离原理来捕获目标区域。产物可以覆盖20000个以上的基因,超过二百万个DNA寡核苷酸探针捕获目标区域,覆盖区域的总大小可以达到64Mb,编码区覆盖度达到97%以上,而且检测灵敏度较高。LibraryPrepKitPureCaptureBeadKitAdapterKit(Aand/orB)pcrReadyMixHybridizationandWashKitDNACovaris打断仪DNA真空浓缩仪金属浴片段大小:180-220bp测序平台:IlluminaGenomeAnalyzerII、HiSeq或MiSeq测序仪实验周期:2天Roche详细实验细节1.杂交(47℃,16-20h)注意事项:Roche详细实验细节16到20cot1-DNARoche详细实验细节Roche详细实验细节Roche详细实验细节外显子捕获效率是什么?外显子测序过程中要用到杂交过程。在人的染色体上有许多与外显子有同源性的部分,这些有同源性的部分很可能在杂交过程中也被捕获下来。所以,测到的序列中,有一部分不是外显子序列。我们把测序得是外显子的部分占全部测序序列的比列称为捕获效率。Nimblegen大约是70%Agilent大约是60%Illumina大约是50%Roche详细实验细节2.磁珠捕获及洗脱洗脱试剂配制--洗捕获磁珠--孵育捕获--洗脱非目标核酸Roche详细实验细节3.pcr扩增9-11Roche详细实验细节AgilentSureSelectXTHumanAllExonV61SureSelectLibraryPrepKit.2SureSelectTargetEnrichmentKitIndexingHybModuleBox#23HerculaseIIFusionDNAPolymerase4SureSelectTargetEnrichmentKitBox#1片段大小:150-200bp测序平台:IlluminaHiSeq、MiSeq实验周期:2天illuminaIllumina,TruSeqExomeEnrichmentKit是近年来刚推出的一种溶液型的序列捕获方法,利用杂交选择分离出人类基因组中的目的外显子区域。通过与目标区域特异的生物素标记DNA探针杂交,富集目标区域,富集的DNA片段随后从磁珠上洗脱,并杂交进行第二次富集反应,从而提高目的片段捕获的特异性。而且较其他产品,illumina外显子捕获试剂盒价格更低。TruSeqExomeLibraryPrepKit片段大小:150bp实验周期:2.5天TruSeqRapidExomeLibraryPrepKit优势:试剂盒包含所有流程反应试剂,周期缩短至1.5天

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