造血干细胞研究进展

1造血干细胞研究进展摘要：造血干细胞是具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体,在人体造血系统中起着至关重要的作用。本文介绍了造血干细胞的生物学特征、表面标志以血干细胞在干细胞移植、细胞治疗和基因治疗等方面的临床应用和前景。造血干细胞(hematopoieticstemcell,HSC)又称多能干细胞,是存在于造血组织中的一群原始造血细胞。也可以说它是一切血细胞的原始细胞,即由造血干细胞定向分化、增殖为不同的血细胞系,并进一步生成血细胞。人类造血干细胞首先出现于胚龄第2～3周的卵黄囊,在胚胎早期(第2～3月)迁至肝、脾,第5个月又从肝、脾迁至骨髓。在胚胎末期一直到出生后,骨髓成为造血干细胞的主要来源。造血干细胞是干细胞中研究最早、最多、最深入的一种,近年来在造血干细胞的多个研究领域均取得了重要进展。1造血干细胞的发现造血干细胞的发现源于第二次世界大战后放射医学的研究，Jacobson等[1-3]发现小鼠与豚鼠的脾脏与骨髓中存在有一类细胞，即造血干细胞，能够重建经致死剂量射线照射过的小鼠与豚鼠的造血系统。随着单克隆抗体技术与流式细胞分选技术的出现，人们利用多种针对细胞表面抗原的抗体组合，分离到相对较纯的小鼠与人骨髓与胚胎组织中的造血干细胞与造血前体细胞群(hematopoieticprogenitorcell)。其中，美国斯坦福大学Weissman实验室在分离与鉴定小鼠与人的造干细胞方面所做的工作最为杰出[4-9]。长期以来，对于造血干细胞是由多种不同的、可以分化成不同种类成熟细胞所组成，还是由一类可以分化成所有造血系统成熟细胞所组成，人们存有争论。直到1996年，Osawa等[10]通过单个细胞移植的方法，验证了一个造血干细胞就可以重建机体整个的造血系统，才结束了对于这一问题的争论。2对小鼠造血干细胞的早期发生的研究造血干细胞的发生到目前为止，人们对于小鼠造血干细胞的早期发生研究得相对较多。小鼠胚胎在完成原肠运动(gastrulation)后不久，一群中胚层的细胞2就被“决定”(determined)将要分化成造血细胞。小鼠胚胎中的多个组织，如卵黄囊(yolksac)、主动脉-性腺-中肾(theaorta-gonadmesonephrosregion，AGM)、胎盘以及胚肝，都先后参与了造血细胞的发生[16,17](图1)。最早的造血干细胞在第7.5天胚胎外的卵黄囊中出现[18]，这时候的造血干细胞主要分化成有核的红细胞，这个时期的造血称为“原始造血”(primitivehematopoiesis)。对BMP-4基因敲除小鼠的研究显示，BMP(bonemorphogeneticprotein)信号通路参与了原始造血的过程[19]。原始造血只短暂存在于小鼠胚胎的第7至11天，主要的功能是为快速生长的胚胎提供氧气供应，随后即迅速消失。在胚胎的第8.5天，AGM区域出现第二波造血干细胞[20,21]，这时候胚胎内部的血液循环开始建立，这个阶段的造血称为“永久造血”(definitivehematopoiesis)。永久造血产生的造血干细胞可以分化成造血与免疫系统的所有终端分化细胞，其造血干细胞的功能可以一直延续到成年以后。在小鼠第10天的胚胎中，造血干细胞开始向肝脏迁移，到胚胎第12.5天时，胚肝成为胚胎最主要的造血器官。在胚胎期的第16天时，胚肝的造血干细胞开始向骨髓中迁移[6]，这种迁移一直持续到出生后。最终，骨髓成为成体动物最主要的造血器官。关于发生在卵黄囊的“原始造血”与发生在AGM区域的“永久造血”，究竟具有共同的还是相对独立的起源，目前依然存有争论。3造血干细胞的生物学特征造血干细胞是体内各种血细胞的唯一来源,存在于骨髓、脐血和外周血中,具有自我更新或自我维持能力、高度增殖潜能、多向分化潜能。3.1自我更新或自我维持能力正常情况下,HSC经过不对称性有丝分裂形成两个子代细胞。其中一个仍维持造血干细胞的全部特征,即自我更新(self-renewal)。自我更新使得干细胞池的大小(干细胞数量)和质量维持不变,因而又称为自我维持(self-maintenance)。另一个子细胞在有丝分裂过程中特征发生改变逐渐走向分化的途径,成为不同谱系的祖细胞、前体细胞和成熟的血细胞,替代消耗或者衰老的细胞,从而维持循环的各种血细胞的数量。3.2高度增殖潜能3在骨髓中,HSC约占骨髓细胞的0.05%,且大多数处于G0期。正常生理情况下,仅需不足10%的HSC处于增殖状态就足以维持机体恒定造血[1]。放、化疗造成造血细胞群明显耗竭或在某些细胞因子和HSC动员剂等因素作用下,HSC能大量地分裂,从而有更多的HSC进入细胞周期。3.3多向分化潜能HSC不仅可分化为各系统的血细胞系,如红细胞系、粒细胞系、单核-吞噬细胞系、巨核细胞系以及淋巴细胞系,还具有可塑性,可向某些非造血细胞转化[2],如神经细胞、骨骼肌细胞、肝脏细胞、血管内皮细胞以及多种组织的上皮细胞等。4、造血干细胞的生物学特征造血干细胞(HematopoietieStemCell,HSC)是一小群具有高度的自我复制和多向分化潜能的最原始的造血细胞。它具有2个重要的特征:l)高度的自我更新或自我复制能力;2)可分化生成所有类型的血细胞。在发育生物学上,造血干细胞属于成体干细胞的一种。又因其可分化出至少12种血细胞,所以造血干细胞是一种多能的干细胞。正常情况下,造血干细胞经过不对称性有丝分裂形成两个子代细胞。其中一个仍维持造血干细胞的全部特征,即自我更新(sel--fernewal)。自我更新使得干细胞池的大小(干细胞数量)和质量维持不变,因而又称为自我维持(sel--fmiantenance)。另一个子细胞可能由于基因表达模式发生改变而使得细胞特征出现变化,从而逐步走上分化的道路。现已知道,造血干细胞不是纯一的细胞群体,而是由不同年龄等级的干细胞组成。这些不同年龄等级的干细胞的表面抗原、免疫表型和粘附分子的表达不一,生物学特性也有一定的差异。5造血干细胞的表面标志HSC存在着不同发育阶段、数量极少、体积较小、比重较轻、形态相似,没有特异的形态学特征,至今仍不能单从形态学上来识别。因此要对HSC进行研究,首先必须能把它从造血组织中分离出来。最常用的方法就是利用HSC表面的标志蛋白对其进行分离。5.1CD34抗原CD34分子为105～120kD的高度糖基化的I型跨膜糖蛋白,选择性表达于早4期造血干/祖细胞、小血管内皮细胞及胚胎成纤维细胞表面,可能具有细胞间粘附、阻遏造血细胞分化等功能,随着细胞分化成熟逐渐减少甚至消失。CD34+造血干细胞是一组异质性细胞群体,可进一步分化为CD34+CD38-和CD34+CD38+两个亚群。CD34+细胞群中90%为祖细胞,极少为HSC。最近研究表明,绝大多数CD34+细胞同时表达CDCP1,分离纯化的CDCP1细胞可使NOD/SCID小鼠重建造血,提示CDCP1是一种新的造血干细胞表面抗原标志[3]。近年应用Ly5抗原等位基因不同的大鼠品系进行竞争性长期重建(competitivelongtermrecon-sititution,CLTR)分析,发现大鼠体内存在有CD34-的HSC群,并可分化为CD34+的HSC[4],同时在人、豚鼠和恒河猴骨髓细胞以及人脐血中亦发现具有长期重建造血能力的CD34-细胞,并且在长期培养后可形成集落,伴随集落的形成亦由CD34-转变为CD34+,可见,CD34+造血细胞起源于CD34-。CD34表面标志从无到有,又从有到无,充分显示了造血干/祖细胞产生、发育、分化和成熟的全过程。5.2胸腺抗原-1(Thy-1,CD90)Thy-1抗原作为造血干细胞比CD34分子出现得早,Thy-1是细胞表面I型糖蛋白连接分子,表达在早期造血细胞表面,与细胞间粘附有关,介导负增殖信号,抑制细胞的增殖分化[5]。CD34+Thy-1+细胞约占CD34+细胞群的0.1%～0.5%,是具有高度自我更新能力和多项分化潜能的造血干细胞。因Thy-1+是造血干细胞表面的早期标志,故可利用其为标志进行造血干细胞的筛选[6]。5.3血管内皮生长因子受体-2(vascularendo-thelialgrowthfactorreceptor-2,VEGFR-2,又称KDR)Ziegler[7]提出KDR是鉴定干细胞的标志,并可由此鉴别干细胞和祖细胞。用RT-PCR证实,在人出生后的造血组织中,0.1%～0.5%的CD34+细胞表达KDR,多能造血干细胞只存在于CD34+KDR+细胞部分,而CD34+KDR-细胞亚群则主要包括一些系特异的定向祖细胞。用有限稀释法分析接受异种骨髓移植小鼠CD34+KDR+细胞中的HSC的比例结果证实,在骨髓中,HSC的比例为20%,经12周长期培养(LTC)分析,骨髓、外周血和脐血中HSC可达25%～42%,如在长期培养过程中添加VEGF,HSC的比例可增至53%～63%。因此,KDR是一个可用于定义造血干细胞,并使其区别于造血祖细胞的阳性功能性标志。5.4干细胞因子受体(SCFR,又称c-kit,CD117)5CD117可编码一种穿膜酪氨酸激酶受体分子,应用单克隆抗体证明此分子可存在于造血干细胞膜上,约60%～75%的CD34+造血干细胞同时表达CD117。其配体--干细胞因子(stemcellfactor,SCF)在造血干细胞的生存和增殖分化中起着重要作用,研究发现CD34+CD117+比CD34+CD117-细胞具有更高的集落形成能力。CD117也存在于肥大细胞和急性髓样白血病细胞表面。5.5AC133抗原AC133是更早期造血祖细胞和造血干细胞的特异性标记。它是一相对分子质量为120kD的糖蛋白,可与一种新的杂交瘤细胞系所产生的抗干细胞糖蛋白抗原的单克隆IgG抗体特异性结合。AC133选择性地表达于人胎肝、骨髓和外周血中的CD34+造血干/祖细胞表面。与CD34抗原表达不同的是,AC133抗原不表达在人脐静脉血管内皮细胞、KGla细胞(AML细胞系)或纤维母细胞上,同时,AC133+细胞群含有比CD34+细胞群更多的早期造血细胞,再植效率更高,而且与白血病和内皮细胞关系密切[8,9]。6造血干细胞的可塑性(Plastieiyt)造血干细胞的可塑性是指除可以分化为各系血细胞外,还可以分化为多种非造血组织的细胞,如神经细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、肝脏细胞、血管内皮细胞以及多种组织的上皮细胞等。目前对造血干细胞多向分化的机制仍不清楚,对这一机制的探讨以及对造血干细胞定向分化的调控将大大扩展其在临床上的应用。因为这不仅可以绕过用人的胚胎干细胞作为移植治疗的细胞来源,而且可以减轻异基因移植带来的免疫排斥问题。7造血干细胞的临床应用造血干细胞正广泛应用于一些疾病的治疗,并取得了可观的疗效,成为干细胞研究和应用的成功范例。7.1细胞治疗细胞治疗,即给患者输注治疗细胞,通过这些细胞在体内发挥功能以达到治病的目的,如抗肿瘤等。目前已建立了体外诱导扩增树突状细胞(DC)的方法,可以从脐带血或自体的外周血干细胞诱导扩增出大量的DC,进一步使其装载肿瘤特6异性抗原后,诱导抗原特异性CTL杀伤肿瘤细胞。DC回输疗法已成功地试用于非何杰金淋巴瘤、黑色素瘤、前列腺癌和多发性骨髓瘤等恶性肿瘤晚期患者的治疗。7.2基因治疗基因治疗是指将外源基因或核酸导入人体防治疾病的一种技术和治疗方法。为了使带有目的基因的细胞在病人体内长期或永久地表达,必须选一种能在体内自我更新和自我维持的永不消亡的细胞作为宿主细胞。造血干细胞因其能自我更新、多向分化,在体内常态造血过程中永不耗竭,同时在分化过程中能保持基因组DNA的相对稳定,从而成为某些疾病基因治疗的一种理想靶细胞。利用造血干细胞作为基因治疗的靶细胞其优势在于:(1)取材容易,来源于患者自体或脐带血;(2)自我更新能力强,有利于基因长期、稳定的表达;(3)造血干细胞具有向各系分化的能力,由其分化而成的细胞便可随血液循环分布到身体各处,利于其所揭带的外源基因更大限度地发挥治疗作用;(4)造血干细胞无论在