HE染色

HE染色试验技术及注意事项HE染色又称苏木素-伊红染色法，是普通光学显微镜观察与鉴别细胞凋亡与细胞坏死的一种染色方法。报告内容HE染色原理试剂染色步骤注意事项几种常见的染色问题HE染色原理苏木素苏木红蓝色色精分化和蓝化氧化+铝细胞核负电荷色酸（染料有色部分）伊红染色染色正负电荷的极性吸附正电荷色酸（染料无色部分）水解渗透作用或者弥散作用完成试剂苏木素染液（细胞核着色）盐酸乙醇分化液稀氨水伊红染液二甲苯梯度浓度乙醇染色步骤常规脱蜡苏木素染色（5-15min），水洗盐酸乙醇溶液分化（30s），水洗伊红染色（1-3min），水洗氨水反蓝（30s），水洗90%乙醇（5min）80%乙醇（30s）100%乙醇（2次×10min）二甲苯（3次×5min）封片染色脱水透明封片脱蜡染色的时间，应根据室温，及组织的具体情况来确定，做之前做预实验。注意事项（1）脱蜡。切片脱蜡后才能染色，且脱蜡应彻底。脱蜡好坏主要取决于二甲苯的温度和时间，如果二甲苯是用过一段时间，切片又比较厚，室温低应增加脱蜡时间，脱蜡不净是影响染色不良的重要原因之一。（2）染色。根据实际情况，通过预实验得到最佳染色时间。一般情况下新配的苏木素染液中只需染1~3min左右，应根据染片的多少，逐步把染色时间延长。分化时间不易过长，分化应在镜下观察，分化过度，应水洗后重新在苏木素染液中染色，在水洗分化和使切片在自来水或稀的氨水中充分变蓝（蓝化）。新配的伊红染色块，切片染色不易过长，应根据染切片的多少逐步延长染色时间，切片使伊红染后，分化时间要短。（3）脱水。染色后通过各级酒精脱水，从低浓度到高浓度。低浓度酒精对伊红有分化作用，切片经过低浓度时要短，向高浓度逐渐延长脱水时间，脱水不彻底，使切片发雾，在显微镜下组织结构模糊不清。（4）透明与封片。切片染色脱水后必须经二甲苯处理，使切片透明，才能用树胶封片。应引起注意的是，二甲苯纯度不纯使切片透明不够，会影响切片质量。几种常见的染色问题脱蜡：切片中白色的区域脱蜡不彻底，染色液由于石蜡斑点的残留而不能渗透着色。原因：①烤(烘)片温度太低，脱蜡前没有充分烤(烘)干。②二甲苯脱蜡时间不足，或二甲苯使用过久，造成脱蜡不尽。对策：①用无水乙醇去掉玻璃片上的水分，重新二甲苯脱去石蜡。②切片需退回到脱蜡步骤，延长脱蜡时间，或跟换二甲苯，驼色、漂白、重新染色。染色：（1）苏木素染色原因：染色时间短；苏木素过度氧化，失去染色能力；分化时间过长。苏木素染色太浅，细胞核与细胞质颜色对比度差。对策：切片重新染色。细胞核过染，核膜、核仁等不清晰，细胞质(尤其是皮肤上皮细胞)含有大量的细胞核染色液苏木精，导致细胞核与细胞质比例失调。原因：与图2相反，染色液时间过长、切片太厚、分化步骤时间太短。对策：如果切片不是因为太厚，脱色、漂白、重新染色，对于染色和分化时间做些适当的调整。若太厚则需要重新切片。切片细胞核棕色，表明苏木精没有充分蓝化，或苏木精过度氧化失去染色能力原因：苏木精染色液过度氧化和切片在苏木精染液染色后返蓝不足。对策：染色前检查苏木精染色液的染色能力，过渡氧化，应及时更换。其次，在苏木精染色后，给切片以足够的蓝化时间。染色后有杂质原因：苏木精染色液中的金属膜，黏附在玻片上。对策：每天染色前仔细过滤苏木精染色液，或建议使用半氧化苏木精染色液。（2）伊红着色切片中央区域伊红染色不均匀，可能为弱碱性溶液残留导致伊红拒染所致原因：伊红染液的pH值可能大于5；也可能是蓝化液残留过多；切片太薄；或切片经伊红染色后在乙醇脱水时间过长。对策：检查伊红染液的pH值，用乙酸将其调节在4.6-5.0之间，使伊红染色色彩艳丽。确保每次蓝化后，用自来水冲干净。检查切片的厚度。脱水时不要让切片在低浓度乙醇停留时间过长，因为含水多的低浓度乙醇会将伊红的颜色分化掉。原因：伊红染色液浓度太高；切片在伊红染色时间过长；切片在伊红染色后经乙醇脱水步骤时过的太快，而使乙醇分化伊红的作用不能产生。对策：适当稀释伊红染色液，减少伊红染色时间，或者使切片在乙醇脱水等步骤时，停留时间相对均匀。同样，也要检查切片的厚度是否合适。伊红深染导致细胞核与细胞质没有层次，缺乏对比在显微镜下呈现大量水珠或云雾状改变原因：切片经梯度乙醇处理后没有完全脱水，导致二甲苯透明中性树胶封固后残留大量水分。也可能是封片的时候出现的气泡。对策：移去盖玻片，用二甲苯溶解封固剂如中性树胶。将切片置入新鲜的无水乙醇换几道。待切片重新脱水完全后，用新二甲苯透明，中性树胶封固。所有用于脱水和透明的液体，在使用一定时间以后，应即时更换。将切片浸如二甲苯中，重新封片。封片：盖玻片上有封固剂所致切片组织模糊不清原因：盖玻片上可能有封固切片的封固剂。对策：移去盖玻片，重新用干净的盖玻片封片。封片后镜下则会出现类似色素的点状结晶或类似“裸核”样的改变原因：切片封片前放置在空气中时间太长，以至于二甲苯挥发切片干燥所致。对策：移去组织切片上的盖玻片和封固剂，重新处理。将切片水洗数分钟，然后重新脱水、透明、封固。封片过程中要保持组织切片的轻度湿润，尽量不要让其干燥。原因：盖玻片弯曲或不平整；封固剂含二甲苯过多，稀释过度。对策：移去盖玻片，重新找一张盖玻片，用干净的封固剂封片。如用手工封片法，每天保证盛装封固剂的容器，在封固结束的时候盖紧盖子。尽量使用小的容器盛装封固剂，一旦封固剂太粘稠，就可以废弃不再使用。谢谢！