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动物细胞与组织培养克隆培养法单克隆抗体细胞核移植动物的克隆常用技术动物细胞融合动物克隆的技术基础是动物细胞与组织培养细胞工程的主要手段是细胞培养和细胞融合皮肤移植显生机动物细胞、组织的培养当一个人烧伤需要皮肤移植的时候,最好移植谁的?•1、其他人•2、父母•3、一般兄弟或姐妹•4、同卵双胞胎兄弟或姐妹•5、自己资料：培养细胞的生存环境1.无菌、无毒环境：添加一定量的抗生素，定期更换培养液2.适宜的温度和PH：35-37℃;PH:7.2-7.43.气体环境（CO2培养箱）：95%O2＋5%CO24.特殊的培养液：主要有：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等模拟人和哺乳动物细胞在体内的最适环境思考：较植物组培培养基有何独特之处？1.液体培养基；2.葡萄糖.3、动物血清含激素，保证细胞顺利生长增殖细胞的全能性细胞株、细胞系植物体培养结果获得细胞或细胞产物培育新植株等培养目的葡萄糖、动物血清蔗糖、植物激素培养基特有成分液体培养基固体培养基培养基性质细胞增殖原理动物细胞培养植物组织培养比较项目植物细胞和动物细胞培养的比较思考几个问题•1、在大多数细胞培养中都不直接使用人的皮肤作为材料而是选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织,为什么？2、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？3、胰蛋白酶的作用？胃蛋白酶可以吗？4、为什么要分装？5、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？培养的细胞会因细胞密度过大和代谢消耗引起营养枯竭，不能正常生长。不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体因为这些组织或器官上的细胞生命力旺盛，分裂能力强成块组织不利培养，分散了做成细胞悬浮液利于培养一、动物细胞培养首先，将动物体内的一部分组织取出，经过机械消化或胰酶消化，使其分散成单个细胞；然后，在人工控制的培养条件下，使这些细胞得以生存，并保持生长、分裂乃致接触抑制和有规律的衰老、死亡性能等生命活动现象。注意：细胞之间在生命活动中相互依存，所以也像体内一样呈现一定的组织特性。细胞贴壁细胞贴壁：细胞培养时，悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。要求：培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴附。在培养的过程中，细胞会结构和功能的变化细胞在贴壁生长过程中,随着细胞分裂,数量不断增加,最后形成一个单层,此时细胞间相互接触,细胞分裂和生长停止。接触抑制有关概念原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。一般是指从开始到传至10代细胞的培养传代培养：将原代细胞分成若干份，接种到其他培养基中，使其继续生长繁殖。传代培养一般指10-50代细胞的培养细胞系、细胞株细胞株：通过一定的选择或纯化方法，从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质的细胞，称为细胞株。特点：一般具有恒定的染色体组型、同功酶类型、病毒敏感性和生化特性等。连续细胞株：可以连续多次传代的有限细胞株：可传代次数有限细胞系：泛指可以传代的细胞；细胞株:具有特殊性质的细胞系小资料1、二倍体细胞通常为有限细胞系2、连续细胞系被认为是发生转化了的细胞系，大部分具有异倍体核型。有的连续细胞系是恶性细胞系，具有致癌性；有的连续细胞系获得了不死性，但保留接触抑制现象，不致癌。细胞系有限细胞系（二倍体）连续细胞系（异倍体核型）恶性细胞系-异体致瘤不死性-不致癌二、动物组织培养动物组织培养：动物组织在体外及人工条件下维持生活状态或生长特性。注意点：1.动物组织培养过程中可以伴随组织分化2.由于细胞运动，组织成分会发生结构与功能的变异，最终还是成了简单的细胞培养。三、动物器官培养器官的原基、器官的一部分或整个器官在体外和人工控制的条件下得以保存生长，在此过程中保持器官的结构、功能及分化能力动物细胞的培养和克隆形成1、广义的动物组织培养(组培)包括：2、动物组织培养技术的发展：1885年，鸡神经板在生理盐水中培养成活。1903年，皮肤及白细胞培养于腹水及血清中，存活1个月。1907年，美，蛙胚神经管培养在蛙淋巴液中，观察到细胞的阿米巴运动，创立了悬浮培养法。细胞培养、组织培养和器官培养。自然培养基1951，建成海拉细胞系，进入全新阶段★如何获得纯系的细胞系？把一个细胞从群体中分离出来培养（克隆培养法）二、克隆培养法1、克隆培养法概念：把一个细胞从群体中分离出来培养，使之繁殖成一个新的细胞群体的技术。（克隆培养与群体培养是一个等位概念）2、特征：纯系（遗传性状均一、表现性状相似）3、基本要求：必须保证分离出来的细胞是一个而不是多个。4、克隆的难易程度:•单细胞不如群体细胞•原代细胞、有限细胞系＜连续细胞系、转化或肿瘤细胞5、提高克隆形成率的措施：选择适宜的培养基、添加血清（胎牛血清）、滋养细胞（如经射线照射本身是去增值力的小鼠成纤维细胞）、激素（胰岛素等）刺激、CO2培养箱、调节PH值等6、用途：如从普通细胞系中分离出缺乏特殊基因的突变细胞系。三、动物的细胞融合技术及其应用★什么是细胞融合技术？★为什么要进行细胞融合？★如何实现细胞融合？定义指用自然或人工方法,使两个或多个不同的细胞融合成一个细胞的过程。不同基因型的细胞之间的融合就是细胞杂交。1、动物细胞融合受精作用两个细胞正在融合诱导融合的因素•生物法：灭活的仙台病毒诱导融合利用灭活仙台病毒是动物细胞融合所特有的。这是由于病毒的磷脂外衣与动物细胞的膜十分相似的缘故。病毒外壳上的某些糖蛋白可能还有促进细胞融合的功能。•化学法：聚乙二醇诱导融合因为聚乙二醇易得、简便，且融合效果稳定，是目前应用最广泛的方法。•物理法：电刺激诱导融合病毒颗粒黏附细胞表面细胞膜连接细胞膜被病毒颗粒穿通细胞融合、形成杂种细胞5、应用1.由于细胞杂交中染色体容易丢失，因此利用杂交细胞检测特定染色体丢失与特定基因产物减少的对应关系，可以进行基因定位。3.利用杂交瘤技术，制备单克隆抗体。2.克服远缘杂交不亲和的障碍鼠—鸡、鼠—兔、鼠—猴、人—鼠、人—兔、人—鸡、人—蛙、酵母菌—鸡、人—胡萝卜等此技术有什么缺点和优点？读下面一段文字资料，思考以下问题：长期以来，为了获得抗体，采用的是把某种抗原反复注射到动物体内，然后从动物血清中分离出所需抗体的方法。用这种方法获得的抗体，不仅产量低，而且抗体的特异性差，纯度低，反应不够灵敏。人们发现，在动物发生免疫反应的过程中，体内的B细胞可以产生多达百万种以上的特异性抗体，但是每个B细胞只分泌一种化学性质单一、特异性强的抗体。要想获得大量的单一抗体，必须用单个B细胞进行无性繁殖，即克隆。1.运用已学知识，设想怎样获得单一类型的抗体？2.能否用单个B淋巴细胞通过克隆形成的细胞群来产生单一类型的抗体呢？设计方案：一个B淋巴细胞－－只分泌一种特异性抗体小鼠骨髓瘤细胞－－能无限增殖-化学性质单一、特异性强的抗体。杂种细胞单克隆抗体•尔斯坦(阿根廷)和科勒(德国)因此在1984年获诺贝尔奖。1.用外界抗原刺激动物（如小鼠，兔子等），使其产生免疫反应，使B淋巴细胞产生抗体；2.利用仙台病毒或聚乙二醇等作为介导，使经免疫的动物的脾细胞与可以无限传代的骨髓瘤细胞融合；（3）经过筛选、克隆培养，获得来自单一细胞的既能产生特异抗体、又能无限增值的杂交瘤细胞克隆单抗的制备过程1.体外培养：通过动物细胞培养技术获得大量的杂交瘤细胞，从细胞培养液中获得的单克隆抗体；2.体内培养：将杂交瘤细胞注射到小鼠的腹腔中增殖，最后从小鼠的腹水中提取、纯化单克隆抗体。思考：（1）为什么用小鼠骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合？细胞的同源性越近，融合形成的杂种细胞越易成活。继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体。（2）骨髓瘤细胞是癌细胞吗？有无限增殖能力的细胞是肿瘤细胞，而具有转移能力的肿瘤细胞，称为癌细胞，所以瘤细胞不能等同于癌细胞。（3）制备过程为何要经过两次筛选？第一次筛选获得多种杂交瘤细胞第二次筛选出特异抗体的杂交瘤细胞。(5)本过程利用了哪些原理？免疫原理、细胞融合原理、动物细胞培养原理（4）制备过程中应用哪些细胞工程技术手段？细胞融合技术、细胞培养技术。四、动物的克隆繁殖★理论上，分化的动物细胞能像植物细胞一样脱分化、再分化成一个动物体吗？★动物细胞实际上表现出全能性的情况如何呢？受精卵胚胎干细胞多能干细胞单能干细胞体细胞四、动物的克隆繁殖（一）动物细胞全能性的表现程度如多能造血干细胞：可分化为红细胞、白细胞、血小板等（2）低等动物细胞：全能性一般容易体现。如水螅的上皮细胞，不经过分裂就可以转变为上皮、肌肉细胞。（1）高等动物细胞（二）动物难以克隆的根本原因在动物的个体发育过程中，分化的结果使得细胞在形态和功能上高度特化，这是由于细胞在伴随着它们发育过程中在时间、空间的变化，基因表达的调控使得细胞中合成了专一的蛋白质。•动物的基因组中，一类基因是维持生存的，在各种细胞中都处于活动的状态。另一类基因随着组织器官和发育阶段不同而选择性表达。•分化的细胞内基因的活动很不完全，因此很难像受精卵那样发挥细胞全能性。胚胎细胞核的移植成功率远高于成体细胞(三)细胞核移植实验和动物的克隆繁殖1、过程：利用一个细胞的细胞和来取代另一细胞中的细胞核，形成一个重建的“合子”胚胎细胞核移植体细胞核移植哺乳动物-核移植实验第一步，将小鼠囊胚内细胞团的细胞核一直到去核的受精卵中，将重组细胞培养到发育为囊胚；第二步，将此早期胚胎植入同步孕鼠子宫中。绵羊“多莉”克隆过程：克隆羊成功的分子细胞生物学机理：供体核DNA中有来源于乳腺细胞细胞质的调节蛋白，它阻止了核基因的表达。重组卵细胞，基因的转录没开始，无调节蛋白重组移核细胞丢失了源于乳腺细胞的调节蛋白。经过三次分裂后，原乳腺细胞的调节蛋白便全部被卵细胞质中的蛋白因子替换了，因此核DNA被重新编排，细胞开始表达自己的基因。体细胞克隆成功的意义：1、证明了高度分化的细胞也可以回复到类似受精卵时期的功能。2、证明了细胞质具有调控细胞核发育的作用。应用：为遗传疾病的治疗、优良品种的培育等提供了重要途径；对濒危动物的保存也有重要意义。克隆成功的条件（必备的基础）P20•1、具有包含物种完整基因组的细胞核的活细胞。(如乳腺上皮细胞)•2、能有效调控细胞核发育的细胞质物质。（如去核的卵的细胞质）•3、完成胚胎发育的必要的环境条件。（如诱导核-质重组细胞生长、分化的实验条件和怀胎母体的子宫环境）思考题1、植物组织培养过程将组织分散成单个细胞的吗？２、动物细胞培养过程将组织分散成单个细胞的吗？３、为何动物细胞培养过程将组织分散成单个细胞的呢？４、如何将动物组织分散成单个的细胞呢？５、胰蛋白酶的作用是什么呢？由此可说明细胞间的物质是什么成份？没有是成块的组织细胞靠在一起,彼此限制了细胞的生长和增殖先用剪刀剪碎,后用蛋白酶处理胰蛋白酶水解蛋白质细胞间的成份是蛋白质思考题６、细胞膜的主要成份是什么？７、胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？８、既然胰蛋白酶能将细胞消化掉，那将动物组织分散成单个细胞要注意什么问题呢？９、能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？１０、动物细胞培养取材时，一般是取胚胎组织或幼龄动物的组织或器官，请解释原因？蛋白质和磷脂能注意时间的控制不能，因为两的最适PH不同，而正常组织细胞的生存环境与胰蛋白酶的最适PH较接近胚胎组织或幼龄动物的组织或器官分裂、增殖旺盛思考题11、动物细胞培养瓶内表面为何要光滑、无毒？12、培养瓶中的细胞培养到什么时候就不再分裂、增殖？13、如此时细胞数量并未达到人们的需求，应该怎样办？易于培养细胞贴壁，进行生长增殖当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞分裂就会停止分裂增殖，这种现象叫接触抑制。将贴满细胞壁的细胞用胰蛋白酶处理，然后继续增殖。这样的过程叫做传代培养思考题14、如何理解原代培养和传代培养？15、传代培养的细胞能一直传代下去吗？16、有些为何能一直传下去吗？17、动物细胞培养就是为了得到这些细胞吗？18、人类一般保存的是哪类细胞呢？为什么？上述过程中，在第一培养瓶中培养就是原代培养，之后转移到其它培养瓶中培养就是传代培养不都能发生突变，朝着癌细