受体的放射配体结合分析法

第八章受体的放射配体结合分析法第一节概述受体（Receptor）细胞膜上或细胞内的一些与生物活性物质相互作用并引起特异性生物效应的大分子。一、受体的分类及亚型在细胞内的定位可将受体分为膜受体、核受体（一）膜受体（membranereceptors）由胞膜外、胞膜内及跨膜区三部分组成，配体在细胞外侧同受体的胞外部分或跨膜部分上的特定结合位点结合后，受体的分子构型发生变化，通过膜内部分启动相应的信息传递机制，引起细胞功能变化。根据受体的分子结构和受体后信息传递方式，膜受体又分为四种：图8.1受体示意图（二）核受体（nucleusreceptors）本类受体在细胞核上，与细胞核内特定的DNA结合，通过这种结合影响遗传信息的转录。核受体都是分子量在80～100KD的可溶性蛋白，不含糖基，无酶活性，由一条氨基酸组成。分为四个功能区，A/B区、C区、D区和E区。A/B区在不同受体中差异最大，主要功能是选择和激活基因转录。D区主要作用是受体在核内的定位，是与染色体DNA结合区，上面有一定的氨基酸序列，可以和靶基因上一定的核苷酸序列（反应原件，responseelement）相结合。E区为配体的结合区，并有转录激活作用通常按C区和染色体DNA结合的结构特征，将核受体分为三类：1、糖皮质激素受体类包括糖皮质激素受体（GCR）、盐皮质激素受体（MR）、孕激素受体（PR）及雄激素受体（AR）等。2、甲状腺激素受体类包括甲状腺激素受体（TR）、维生素D3受体（VDR）、维甲酸受体（RAR）及维甲酸X受体（RXR）等。3、雌激素受体类主要为雌激素（ER）。（三）受体亚型受体亚型是指受体分子结构上既有部分相同，也存在一定差别，它们对同一配体具有不同的亲和力，生物学上具有不同的效应。1、用药理学方法可见到，同一种受体的几种激动剂（拮抗剂）对各亚型都有作用，但作用有相对的选择性。如，对于α肾上腺受体，哌唑嗪对血管平滑肌收缩的拮抗作用强（α1），对胃肠道平滑肌舒张的拮抗作用较弱（α2），而育亨宾则相反。2、用放射配体结合分析法可观察到，同一种受体的某些激动剂（拮抗剂）对各亚型都有特异性结合能力，但是亲和力不同。3、用分子生物学技术可观察到，同一种受体的不同亚型的分子结构类似，但基因的编码和氨基酸序列有一定的差异。受体与配体相互作用的基本特点1、可饱和性（Saturabilty）--有限结合能力。2、特异性（Specificity）受体对配体应具有特异性和立体特异性。配体可分为激动剂与拮抗剂3、适度的亲和力（Affinity）受体对它的配体的亲和力，或配体占据受体的浓度范围，应该相当于体内配体的生理浓度，通常是10-9mol/L。4、可逆性（Reversibility）受体与配体的结合反应是可逆的。可逆性还表现在已经结合的配体可被另一种与受体亲和力更高的配体取代。5、识别能力（Recognition）和生物效应一致性受体与配体的特异性结合保证了受体对机体内成千上万生物活性物质的高度识别能力。这种能力与配体引起的生理（药理）效应相一致。表现在：（1）、在组织分布上的一致。（2）、在浓度上的一致。受体主要存在于相应配体发挥生理或药理效应的器管，称之为靶器管。有的配体生理或药理效应广泛，而另一些配体的作用则有明显的器管专一性。配体和受体结合的有效浓度通常也应该和该配体发挥生理或药理作用的浓度一致。6、需具有内源性配体一般受体都有内源性配体，如果通过外源性配体发现某种蛋白分子具有类似受体的结合特性，但未能找到内源性配体，则称之为孤儿受体（Orphanreceptor），还不能看做肯定是真正的受体。RBA（Radioligandbindingassayofreceptors）用放射性核素标记的配体与相应受体进行特异性结合反应，从而对受体进行定性和定量，即称为受体的放射配体结合分析法。RBA定量RBA在已知配体—受体反应的基础之上，通过结合反应得知一定量的组织或细胞能与该放射性配体结合的受体数（又叫结合位点数，Numberofbindingsite）和亲和力（以解离常数KD表示）。定性RBA通过反应量效关系，某些参数的变化等判断受体的类型，单位点和多位点系统，受体与配体相互作用的特点等。第二节、单位点系统RBA的基本原理一、受体与配体相互作用的基本特点二、简单单位点系统受体配体相互作用的基本规律二、简单单位点系统受体配体相互作用的基本规律简单单位点系统:受体与配体结合的系统只存在一种结合位点.1.质量作用定律:受体与配体的结合反应最基本的性质是服从可逆反应的质量作用定律.[R]+[L][RL]v1---复合物形成速率k1_---复合物形成速率常数v2---复合物解离速率k2_---复合物解离速率常数v1=K1[R][L]v2=K2[RL]反应平衡时v1=v2k1v1k2v2反应平衡时v1=v2平衡解离常数KD==KD=1/KA，单位为：mol/LKD越大，亲和力越低][]][[21RLkLRk][]][[RLLR12kk设受体和配体的初始浓度分别为[RT]、[LT]则[R]=[RT]-[RL][L]=[LT]-[RL]代入：KD=整理后得：[RL]2-[RL][RT+LT+KD]+[RT][LT]=0因为[RT]、KD为定值所以[RL]仅随[LT]而变化，两者呈双曲线函数关系][]][[RLLRLRT][]][[RLRLLTRLRT2.饱和曲线:简单单位点系统RBA具有典型的饱和曲线--------------以[RL]为纵坐标[LT]为横坐标,得到的得到一条曲线(Saturationcurve).图8-2KD对饱和曲线的影响图8-3[RT]对饱和曲线影响3.Scatchard作图简单单位点系统在Scatchard作图中呈一直线整理后得:以[RL]/[L]对[RL]作图--------------Scatchard作图斜率=-1/KD[RT]=直线与横坐标的交点][]][[RLLRLRTKD][1][][][RLxKDKDRTLRL图8.4简单单位点系统受体结合分析的Scatchard作图KD相同[RT]不同时[RT]相同KD不同时图8.54.Hill作图得到一条斜率为1的直线重排并取对数以lg([RL]/[RT-RL])-----------------------纵坐标lg[L]--------------------------------------横坐标如果一个受体能和两个或更多(n个)分子的配体结合(KD相同)KD=[RT-RL][L]n/[RL]lg([RL]/[RT-RL])=-lgKD+nlg[L]斜率为n,Hill系数.][1][][][RLxKDKDRTLRL][][][RLRTRLKDL]lg[lg][][lgLKDRLRTRL-lgKDlgKDLg[L]][][lgRLRTRL三、非特异结合放射性配体除与受体特异结合外，与其他的结合统称为NSB特点：1）结合容量大，亲和力小2）无饱和现象3）结合量与所用配体量呈线性关系RBA时，当分离特异结合的复合物测量放射性时，这部分NSB的放射性混在一起，测得的是总放射性（totalbinding，TB），必需先去减去NSB，才能得到特异结合（specificbinding，SB）。最基本的方法是做一系列平行管，所有的条件都与TB管相同，仅是多加了200～1000倍量非标记配体，将SB完全取代，这时测得的放射性计数为NSB。因NSB与放射性配体呈线性，多点饱和法实验中常常只做3、4点，再用直线回归法求出其余各点。图8-73H-组胺与组胺受体特异结合的饱和曲线（○表示NSB,●表示TB，x表示SB=TB-NSB）四、正协同及副协同现象某些情况下，一部分受体与配体结合后可使相临的受体分子亲和力降低------------副协同（Negativecooperativity）反之，亲和力逐步增高，斜率加大，曲线向上凸--------------------------------------------正协同（positivecooperativity）图8.8Scatchard作图中的正负协同作用（1）无协同作用；（2）负协同作用；（3）正协同作用第三节离体RBA的条件和基本方法条件：1.适用的标记配体2.待测受体标本3.适合的缓冲液4.较好的F与B的分离方法RBA的基本方法制备待测受体的离体标本加放射性配体温育一定时间终止反应、分离结合与游离部分测定结合部分的放射性数据处理、求有关参数一、标记配体要求：高度亲和力，特异标记配体的浓度〈受体-配体KD常用的放射性配体：3H-标记物：稳定、生物活性不变、T1/2长、高放射性比活度、专门合成125I-标记物：易标记、高放射性比活度、T1/2短、结构可能变化、比活度不易确定标记配体的基本要求：1.高比活度RBA中受体数目一般很低（0.01～1pmol/mg蛋白），必须用高比活度的标记配体才能得到理想的实验结果。而且比活度高，可减少标记配体的用量。一般要求在3.7×1011Bq（10Ci）/mmol以上。2.亲和力高高亲和力的配体可减少用量，从而降低NSB；且可使标记配体与受体的复合物解离变慢，便于结合与游离配体的分离，易获得准确的实验数据。3.特异性强标记配体应与其他受体的交叉反应少，与研究的受体有选择性结合。理想的标记配体应只与一种受体或受体的一种亚型结合。因此应选择对某一受体或其中一种亚型高亲和力的标记配体。4.放射化学纯度高RBA的计算是以标记配体的用量及比活度为依据，放射性杂质多进可导致计算不准确，一般要求放射化学纯度在95%以上（一）标记配体的用量标记配体的用量要根据实验方案通过预实验进行确定。（1）单点法。通常选一个使受体基本饱和的标记配体量。该方法操作简便，标本量少，标记配体用量少，但只能给出受体的最大结合容量Bmax，且略小于饱和曲线法。（2）多点饱和曲线。每一受体标本做6～8个点（双位点需要更多），标记配体的用量应覆盖受体的不饱和区和饱和区，以得到典型的饱和曲线。此方法能得到RT、KD、反映实验误差大小的平均误差等，可信度高，但工作量也大。二、非标记配体的选择非标记配体----与放射性配体竞争结合同一受体----特异性、亲和力要高----用量=100-10000倍标记配体使绝大部分受体都被非标记配体所占据而不再与标记配体结合三、待测受体标本的制备用于离体RBA的标本大体可分为：组织切片、完整细胞悬液，经初步分离的细胞组分以及经增溶或进一步纯化的受体蛋白等。1.完整细胞悬液的制备2.细胞组成的分离细胞核、浆、膜3.受体的增溶和进一步纯化图8.10分离细胞组分的一般方法沉淀：完整细胞、核受体四、温育条件缓冲液通过多次预实验确定某个受体的最适离子强度和pH时间与温度最适的时间为完全平衡时间温度根据目的不同而不同（0—37OC）结合配体和游离配体的分离平衡透析法KD》1000nmol/L半透膜的使用游离配体可自由透国离心法适用于多数B/F的分离KD=10-1000nmol/L过滤法玻璃纤维膜、醋酸纤维膜负压抽滤、洗涤KD《10nmol/L目的：B/F的分离，一般RIA的分离方法可用于RBA注意配体与受体的解离速度第四节定量RBA的数据处理目的：求受体的RT和KD及其他参数通过测得的样品数据+放射性配体的量、放射性比活度+数学模型的运算一、单位点实验的数据处理TB-NSB=RL（特异结合的CPM）CPM/仪器效率=DPM（RL）DPM/S（比活度）=浓度（mol/L）R：L=1：1------RL的mol数=结合位点数定量蛋白、细胞-------RTmol数1mol=6.02×1023分子数的受体通常是计算饱和区[RT]，即最大结合容量Rmax（maximumbindingcapacity）。单位换算公式为：)%fmolCPMRLRT标本蛋白量（配基比活度）测量效率（的二、单位点系统多点法的数据处理一系列的不同浓度的LT与R结合后得到TBn-NSB=RLn（CPM）以RLn对LT作图=饱和曲线----