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HE染色试剂配置A：0.5~1%的伊红酒精溶液：称取伊红Y0.5~1g，加少量蒸馏水溶解后，再滴加冰醋酸直至浆糊状。以滤纸过滤，将滤渣在烘箱中烤干后，以95%酒精（即工业酒精，如果不怕浪费，用无水乙醇配制也可）100毫升溶解。B：苏木素染液配方：(配制3000ml，可按比列减少)苏木精6g无水乙醇100ml硫酸铝钾150g蒸馏水2000ml碘酸钠1.2g冰醋酸120ml甘油900ml配制方法：将苏木素溶于无水乙醇，再将硫酸铝钾溶于蒸馏水，溶解后将甘油倾入一起混合，最后加入冰醋酸和碘酸钠。C：1%盐酸酒精分化液：将1毫升浓盐酸加入99毫升70%酒精中即可。染色流程(1)二甲苯（Ⅰ）15min(2)二甲苯（Ⅱ）15min（3）二甲苯：无水乙醇=1:12min(4)100%乙醇（Ⅰ）5min(5)100%乙醇（Ⅱ）5min(6)80%乙醇5min(7)蒸馏水5min(8)苏木精液染色5min(9)流水稍洗去苏木精液1-3s(10)1%盐酸乙醇1-3s(11)稍水洗10-30s(12)蒸馏水过洗1-2s(13)0.5%伊红液染色1-3min(14)蒸馏水稍洗1-2s(15)80%乙醇稍洗1-2s(16)95%乙醇（Ⅰ）2-3s(17)95%乙醇（Ⅱ）3-5s(18)无水乙醇5-10min(19)石炭酸二甲苯5-10min(20)二甲苯（Ⅰ）2min(21)二甲苯（Ⅱ）2min(22)二甲苯（Ⅲ）2min(23)中性树胶封固注：①第（11）、（12）步可省去，（13）步冲水时间需延长至20-30min。②第（21）步如果不用石炭酸二甲苯，可改用无水乙醇。*冷冻切片HE染色步骤：（1）冰冻切片固定10～30s（2）稍水洗1～2s（3）苏木精液染色（60℃）30～60s（4）流水洗去苏木精液5～10s（5）1%盐酸乙醇1～3s（6）稍水洗1～2s（7）促蓝液返蓝5～10s（8）流水冲洗15～30s（9）0.5%曙红液染色30～60s（10）蒸馏水稍洗1～2s（11）80%乙醇1～2s（12）95%乙醇1～2s（13）无水乙醇1～2s（14）石炭酸二甲苯2～3s（15）二甲苯（Ⅰ）2～3s（16）二甲苯（Ⅱ）2～3s（17）中性树胶封固。注：第（14）步如果不用石炭酸二甲苯，可改用无水乙醇。染色结果：细胞核蓝色，胞质、肌纤维、胶原纤维和红细胞呈深浅不一的红色。4．12切片脱水透明切片经HE染色后，要彻底脱水透明，才能用中性树胶封盖。如果脱水不彻底，封片后呈白色雾状，镜下观察模糊不清，且容易褪色。切片1-2级无水乙醇脱水，也可使用石碳酸二甲苯进行脱水。石碳酸有较强脱水能力，但长时间可使切片脱色，因此要经过多次二甲苯以使石碳酸完全除去。5.H-E染色评定标准：（1）切片完整，厚度4-6微米，厚薄均匀，无皱褶无刀痕；（2）染色核浆分明，红蓝适度，透明洁净，封裱美观。4染色结果编辑细胞核被苏木精染成鲜明的蓝色，软骨基质、钙盐颗粒呈深蓝色，粘液呈灰蓝色。细胞浆被伊红染成深浅不同的粉红色至桃红色，胞浆内嗜酸性颗粒呈反光强的鲜红色。胶原纤维呈淡粉红色，弹力纤维呈亮粉红色，红血球呈橘红色，蛋白性液体呈粉红色。着色情况与组织或细胞的种类有关，也随其生活周期及病理变化而改变。例如，很多细胞在新生时期胞浆对伊红着色较淡或轻度嗜碱，当其衰老时或发生退行性变则呈现嗜伊红浓染。胶原纤维在老化和出现透明变性时，伊红着色由浅变深。Masson染色,用于显示组织中纤维的染色方法之一。试剂：Regaud氏苏木精：苏木精1g，95%酒精10ml，甘油10ml，蒸馏水80ml。将苏木精加入蒸馏水内加温溶解,冷却后加入酒精和甘油,放数日后即可应用。Masson丽春红酸性复红液：丽春红0.7g，酸性复红0.3g，蒸馏水99ml，冰醋酸1ml。0.2%冰醋酸水溶液：冰醋酸0.2ml，蒸馏水100ml。1%磷钼酸水溶液：磷钼酸1g，蒸馏水100ml。苯胺蓝水溶液：苯胺蓝2g，蒸馏水98ml，冰醋酸2ml。1%光绿水溶液：光绿1g，蒸馏水100ml。Masson三色法步骤1．石蜡切片脱蜡至水。2．铬化处理或去汞盐沉淀（甲醛固定的组织此步可略）。3．依次自来水和蒸馏水洗。4．用Regaud苏木精染液或Weigert苏木精液染核5-10min。5．充分水洗,如过染可盐酸酒精分化。6．蒸馏水洗。7．用Masson丽春红酸性复红液5-10min。8．以2%冰醋酸水溶液浸洗片刻。9．1%磷钼酸水溶液分化3-5min。10.不经水洗,直接用苯胺蓝或光绿液染5min。11．以0.2%冰醋酸水溶液浸洗片刻。12．95%酒精、无水酒精、二甲苯透明、中性树胶封固。结果：胶原纤维、粘液、软骨呈蓝色（如光绿液染色为绿色），胞浆、肌肉、纤维素、神经胶质呈红色，胞核黑蓝色。体会与说明：1．控制好染色步骤。2．组织固定起着很重要的作用，根据不同的固定液可延长或缩短染色时间。3．0.2%冰醋酸水溶液洗，可使色调清晰鲜艳。4．磷钼酸水溶液对丽春红、酸性复红有分化作用，分化时镜下控制，肌纤维和纤维素呈红色，胶原纤维呈淡粉红色即可。天狼猩红染色[试剂配制](1)天狼星红饱和苦昧酸液O．5％天狼星红10ml，苦味酸饱和液90ml。(2)天青石蓝液天青石蓝B1．25g．铁明矾1．25g，蒸馏水250ml。溶解煮沸、待冷却过滤加入甘油30ml，然后再加入浓盐酸0．5ml。[染色步骤](1)中性甲醛液固定组织，石蜡切片，常规脱蜡至水。(2)人大青石蓝液染5一lOmin。(3)蒸馏水洗3次。(4)天狼星红饱和苦昧酸浓染15-30min(5)无水乙醇直接分化与脱水。Devil二甲苯透明，中性树胶封固。[注意事项](1)细胞核里染色可以用Harris苏木素染色液谈染。(2)染色封固后的切片，须及时用偏光显微镜进行观察和照相已保持鲜艳的色彩注：在偏光显微镜下可以观察到四种类型的胶原纤维。l型胶原纤维：紧密排列，显示很强的双折光性，呈黄色或红色的纤维oll型胶原纤维：显示弱的双折光，呈多种色彩的疏松网状分布。皿型胶原纤维：显示弱的双折光，呈绿色的细纤维。lv型胶原纤维：显示弱的双折光的基膜，呈淡黄色。免疫组化步骤（ABC法）1。4%多聚甲醛常规灌注固定，取材并置20%蔗糖溶液（4℃）中过夜。蜡块制作。切片，贴片。0.01MKPBS清洗5min×3后；2。加入配好的0.3%的过氧化氢甲醇溶液（甲醇80ml＋0.01MKPBS100ml＋30%过氧化氢）30min，以消除内源性过氧化物酶的影响，0.01MPBS清洗5min×3；3。加入配好的0.3%TritonX100（30%TritonX100＋0.01MKPBS100ml）30min，以增加细胞的通透性，0.01MKPBS清洗5min×3；4。加入用血清稀释液（牛血清白蛋白1.00g＋0.01MPBS100ml＋叠氮纳0.08g）稀释的一抗，4℃存放24-48h；吸去抗体，0.01MKPBS洗5min×3；5。加入0.01MKPBS稀释的的二抗，室温孵育2h。0.01MKPBS洗5min×3；6。加入ABC复合物之类的抗体，室温孵育2h，0.01MKPBS洗5min×3；蒸馏水迅速冲三次；7。加入显色液，进行免疫组织化学显色，时间一般不超过30min，可不时在显微镜下进行观察，待细胞着色而背底颜色较淡时马上吸去显色液，用蒸馏水迅速冲三次后加入0.01MKPBS终止反应；8。梯度酒精脱水之后，封片，拍照。免疫组化SP法步骤：SP(streptavidin-perosidase)法,即链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法.按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶(主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶)、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、酶标法和免疫金银法等。按染色步骤可分为直接法(又称一步法)和间接法(二步、三步或多步法)；按结合方式可分为抗原—抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法和亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是最常使用的方法。一般的sp法步骤啊,具体如下：1.烤片，68℃，20分钟,2.常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水；二甲苯I20min--二甲苯II20min--100%酒精I10min--100%II10min--95%5min--80%5min--70%5min3.阻断灭活内源性过氧化物酶：3%H2O237℃孵育10min，PBS冲洗3X5min；4.抗原修复:置0.01M枸橼酸缓冲液（PH6.0）中用煮沸（95℃，15－20min），自然冷却20min以上，再用冷水冲洗缸子，加快冷却至室温，PBS冲洗3X5min。5.正常羊血清工作液封闭，37℃10min，倾去勿洗.6.滴加一抗4℃冰箱孵育过夜，PBS冲洗3X5min（用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照）；滴加生物素标记二抗,37℃孵育30min,PBS冲洗3X5min;7.滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，37℃孵育30min,PBS冲洗3X5min;8.DAB/H2O2反应染色，自来水充分冲洗后，苏木素复染，常规脱水，透明，干燥，封片。免疫组化（Elivision二步法）：（1）石蜡切片置于67℃烘箱中，烘片2小时，脱蜡至水，用pH7.4的PBS冲洗三次，每次3分钟（3×3’）。（2）取一定量pH=6.0柠檬酸盐缓冲液，加入微波盒中，微波加热至沸腾，将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，中档微波处理10分钟，取出微波盒流水自然泠却，从缓冲液中取出玻片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用PBS冲洗2×3’。(注：不是所有的抗体都需要微波修复的，视具体情况而定)（3）每张切片加1滴3%H2O2，室温下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3×3’。（4）除去PBS液，每张切片加1滴相应的第一抗体（相应稀释倍数），室温下孵育2小时。（5）PBS冲洗3×5’。除去PBS液，每张切片加1滴聚合物增强剂（试剂A），室温下孵育20分钟。PBS冲洗3×3’。（6）除去PBS液，每张切片加1滴酶标抗鼠/兔聚合物（试剂B），室温下孵育30分钟。PBS冲洗3×5’（7）除去PBS液，每张切片加1滴新鲜配制的DAB液，显微镜下观察5分钟。（8）苏木素复染，0.1%HCl分化，自来水冲洗，蓝化，切片经梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固，晾干后观察。注：即用型第二代免疫组化Elivisionplus广谱试剂盒，购自福州脉新生物技术开发有限公司。包括：生物素化抗兔二抗、亲和素（ReagentA）、生物素－辣根过氧化物酶（ReagentB）、二氨基联苯胺（DAB）脱钙剂的配置10%EDTA的配置：1)加热水浴锅到65℃2)称取NaOH11g加到900mlddH2O中3)再加入EDTA-Na2100g至水中；4)水浴加热，搅拌至透明溶解5)加入Na2HPO46g,NaH2PO40.4g,NaCl9g;蒸馏水定容至1000ml6)调节pH值至7.2~7.3,室温或4度保存