HPLC色谱柱选择

HPLC色谱柱选择东曹达（上海）贸易有限公司色谱柱的选择色谱柱的选择HPLC方法开发时首先要:‹了解方法的目的（分析？制备？）‹了解样品性质（极性？酸碱性？）‹选择合适的色谱柱色谱柱的选择色谱柱的选择„色谱柱和流动相的选择是色谱技术的核心之一„色谱柱的选择是方法开发的一个重要环节„选择合适的色谱柱可以缩短方法开发所需要的时间、并且使开发的方法更稳定„在不合适的色谱柱上进行方法开发通常需要更长的时间、并且成功率较低色谱柱的参数色谱柱的参数色谱柱的参数远比一般认为的要多：„柱长，内径，例如250*4.6mm.„粒径，3um,5um,10um等„孔径，60A，80A，100A，120A等„比表面积，180m2/g-350m2/g（ODS-100V为450m2/g）„基质：硅胶，聚合物等„硅胶表面性质„载碳量，10-20%(ODS-120T为22%)„键合试剂，C18,C8,CN等„封端柱的物理性质柱的化学性质样品性质决定柱的化学性质样品性质决定柱的化学性质„样品结构„溶解性（有机溶剂、水）„pH值„极性„酸碱性„分子量分离目的决定柱的物理性质分离目的决定柱的物理性质„分析?制备?„快速分析?（如Super-ODS）„含量分析?杂质检验?„所有组分分离?色谱柱的参数色谱柱的参数柱长、内径„一般柱长2.0-250mm，柱越长，分离度越高，但柱压更高，分离所需时间更长„分离度与理论塔板数的平方根成正比，所以增加柱长并不是昀有效的分离手段。一般情况下15cm,5um的填料可以提供足够的塔板数„内径：1-2mmLC-MS柱，4.6mm分析柱，10mm以上的半制备和制备色谱柱„HPLC仪器的柱外效应-不同的仪器设备配置有相应的昀佳流速，因此适用于不同内径的色谱柱色谱柱的参数色谱柱的参数基质硅胶：昀通用的基质，强度大，化学修饰容易，但使用的pH值范围有限（一般为2-8，特殊修饰的可以使用到1-12）。下面的介绍也主要是基于硅胶基质的色谱柱技术„聚合物基质：化学稳定，应用pH范围宽,但强度不够大，批重复性相对较差。商品化的色谱柱不多，价格较贵，如Octadecyl-2PW„球型:HPLC使用„无定型:中压色谱使用色谱柱的参数色谱柱的参数粒径„粒径越小，分离越快,柱效越高。但柱压力越高，柱容易被污染，寿命低„LC-MS和常规分析柱通常使用5μm填料。3μm填料使用的困难程度大，一般非必要时不使用(ODS-100V)„Super-ODS为2μm填料，UPLC为1.7μm填料„3cm以下的制备色谱柱通常使用5-10μm填料„更大内径的制备色谱柱通常使用更大的粒径，如10μm,或20μm色谱柱的参数色谱柱的参数孔径„孔径小，含孔率高，则比表面积大，载碳量高„化合物在孔内分离„孔径大小必须和分子大小相匹配，分子必须能进入孔内，一般小分子使用80-120A，大分子通常使用300A。为了达到昀佳分离,一般要求孔径直径是分子直径的3倍以上色谱柱的参数色谱柱的参数比表面积„每克填料的表面积„与粒度、含孔率有关„比表面积大，会增加样品与键合相之间的反应，增加保留、分离度和制备时的上样量„比表面积小可以缩短分析时间和梯度时的平衡时间„并不是比表面积大或者小就更好，选择适合目的的比表面积色谱柱的参数色谱柱的参数载碳量„硅胶表面键合相的比例„与比表面积，键合覆盖度等有关„对ODS，载碳量从7-18%（ODS-100Z为20%）不等„ODS的载碳量高，则保留增加，适合分析非极性化合物。制备色谱的上样量也可以增加„载碳量通常影响选择性色谱柱的参数色谱柱的参数硅胶表面性质-纯度„高纯硅胶表面的重金属含量，一般为ppm级，液相系统的金属部件也会产生重金属（ODS-100V\Z为高纯硅胶）„待测组分与重金属发生螯合反应会导致色谱峰形不佳，产生前伸或拖尾„能与金属形成5或6元环螯合物的待测组分特别容易受重金属影响„可以使用EDTA溶液或稀酸冲洗色谱柱消除重金属影响色谱柱的参数色谱柱的参数硅胶表面性质-硅醇基„硅醇基的酸性较大,可与碱性化合物牢固的结合,因此含有较多残留硅醇基的填料在分离碱性化合物时容易产生脱尾、变宽、保留延长等现象（ODS-100V\Z都进行了彻底封端）„加入适当的扫尾剂如三乙胺可以掩蔽残留的硅醇基,使碱性化合物峰形变好„降低流动相pH值小于3,可以减小硅醇基的反应,从而减小拖尾现象色谱柱的参数色谱柱的参数键合相„超过80%的样品可以使用反相色谱分离，一般方法开发也首先使用反相色谱„C18，C8，C4等反相色谱，从C18到C8，C4，对化合物的保留降低„NH2，CN等可用于正相，也可以用于反相„键合试剂不同，对化合物的选择性不同方法开发时,长链的烷基键合相(C18,C8)比短链的(C4,C3)稳定；非极性的键合相比极性的键合相(-NH2)稳定色谱柱的参数色谱柱的参数昀常用的ODS色谱柱‹R为非极性基团,为通用型色谱柱‹如果R为强极性基团,为通常说的AQ”水性”柱,可以走纯水,用于强极性化合物（ODS-100V可以走纯水）SiRR(CH2)17CH3色谱柱的参数色谱柱的参数SiRR(CH2)17CH3SiCH3CH3(CH2)17CH3XOH+monomericbondingSiCH3X(CH2)17CH3X+polymericbondingOHOHOOSiCH3(CH2)17CH3键合方式柱效高,平衡快稳定性好，制备上样量大色谱柱的参数色谱柱的参数ODS柱的特征结构色谱柱的参数色谱柱的参数封端目的：减小残留硅醇基色谱柱的参数色谱柱的参数封端„未封端的Si-OH基团是碱性化合物拖尾的主要原因„酸性条件下，氢离子通过未封端的Si-OH的间隙进攻-O-Si键，导致填料水解„封端的基团会影响色谱柱的使用pH值、对化合物的选择性等色谱柱的参数色谱柱的参数封端技术ƒ使用小分子硅烷保护残留Si-OHƒ通过R1基团空间位阻保护残留Si-OH如使用异丙基代替甲基ƒ通过键合相之间的连接保护残留Si-OHƒ多次封端色谱柱的参数色谱柱的参数封端的效果：色谱柱的参数色谱柱的参数封端-高封端的ODS色谱柱„pH使用范围宽„极性基团封端的色谱柱可以在高水相流动相条件下使用，适合分离极性化合物„残留的硅醇基影响昀小，碱性化合物不拖尾„改善选择性„一般优先使用高封端的色谱柱封端-低封端或不封端的ODS色谱柱„可用于100%的水相（C18链疏水，在纯水相中会倒塌导致保留降低，因此AQ色谱柱中都有极性的亲水集团或低封端）„因为硅醇基的影响，对极性相同的化合物有特殊选择性色谱柱的参数色谱柱的参数如何选择合适的色谱柱如何选择合适的色谱柱„选用高纯硅胶基质的色谱柱„对碱性化合物，选择高封端的色谱柱„高pH值使用时，需要使用特殊封端的色谱柱，以保证柱寿命，改善峰形(ODS-100S)„大分子量的化合物，需要大孔径的色谱柱„尽量使用低pH值，以减少硅醇基的作用„不同品牌的色谱柱往往有不同的选择性如何选择合适的色谱柱如何选择合适的色谱柱„详细阅读色谱柱的说明，了解各种色谱柱的参数和性质„了解化合物性质：极性，酸碱性，杂质的性质等„强极性化合物使用AQ色谱柱(ODS-100V)„高比表面积和载碳量可以提高制备色谱的上样量硅胶填料：TSK-GEL固定相粒径(μm)炭含量孔径（埃）理论塔板数保持力封端处理耐久性主要特征、用途ODS-100VC183,515%(单层)100高好彻底好ODS首选柱；对碱性化合物分析效果特别好；适于极性化合物的分析；可适用100%水相；LC/MS系统ODS-100ZC18520%(单层)100高好彻底好通用型ODS柱；对酸性、中性、碱性化合物分析效果好；适于中性和疏水性化合物的分析ODS-100SC18518%(多层)100高好较好好通用型、多层ODS柱的标准；良好的化学稳定性（耐酸、碱）ODS-120TC18522%(多层)120高好一般一般通用型高性能柱；炭含量最高；在有机溶剂多的流动相中发挥威力ODS-120AC18520%(多层)120高好未处理一般炭含量高的高性能柱；可发挥填料的离子作用；表面识别能力强，适于分析芳香族化合物等TSKGEL反相色谱柱选择一览表TSKGEL反相色谱柱选择一览表