cobas-z-480及临床应用-耿庆茂-罗氏

cobas®z480实时荧光定量PCR仪及临床应用罗氏诊断耿庆茂18615193388主要内容罗氏诊断简介实时荧光定量PCR及其基本应用罗氏cobasz480实时荧光定量PCR仪介绍诊断健康医护部生命科学部制药制药中外基因泰克专业诊断部分子诊断部组织诊断部1.分为罗氏制药和罗氏诊断两大事业集团2.罗氏制药位列医药界全球前五位3.罗氏诊断已跻身为体外诊断试剂公司全球第一罗氏集团Roche全球战略：独一无二的分子诊断产品系列整合、领先的自动化平台病毒学血液筛查妇女健康基因组学肿瘤学微生物学分子诊断业务部全球分子诊断金标准19851991199319951998200520092011实时荧光定量PCR仪发展简史罗氏不断打破记录将创新的PCR技术推向市场Kary Mullis 发明PCR技术罗氏获得全球PCR专利权罗氏分子系统发明实时定量PCR仪LC480 II上市LC480 上市cobas z 480上市罗氏推出COBAS AmplicorPCR诊断行业金标准Roche最新的PCR仪！Roche最新的PCR仪！cobas z 480实时荧光定量PCR仪同时满足开放性通道UDF及IVD罗氏原装试剂检测数据管理服务器数据储存和分析，并出具最终报告cobasz 480 实时荧光定量PCR仪IVD：用于罗氏配套试剂UDF：用于开放试剂的荧光定量可用于基因表达、基因检测、基因定量、SNP突变检测、基因分型及最新的基因扫描等方面的分析和研究。主要内容罗氏诊断简介实时荧光定量PCR及其基本应用罗氏cobasz480实时荧光定量PCR仪介绍Frombaidu.comPCR•聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析常规PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测荧光定量PCR原理Cycle（循环数）Rn（荧光强度）BaselineLg－liner phase平台期荧光基团荧光检测元件荧光定量PCR原理－－扩增曲线荧光分子简介•荧光是一种光致冷发光现象。荧光分子经某种波长的入射光（通常是紫外线或X射线）照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激发并发出出射光（通常波长比入射光的的波长长，在可见光波段）；而且一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。具有这种性质的出射光就被称之为荧光。12荧光分子的性质(激发和发射波长、强度、寿命、偏振等)可随所处环境的性质，如极性、折射率、黏度等改变而灵敏地改变。•非特异性荧光染料：–1、SYBRGreen–2、ResoLight或LCGreen•特异性荧光探针：–2、TaqMan（Taqman-MGB)–3、MolecularBeacon–4、LNAprobes–5、Scorpionsprimers–6、FRETprobe–7、Allglo探针–8、蝎形引物（Scorpionprimer）：荧光标记引物–9、Amplifluor：荧光标记引物QPCR用什么荧光分子，怎么用？SYBRGreen，FAM，HEX，VIC，TET，JOE，CY3，TAMRA，NED，ROX，CY5，LC-Red等等什么是HRM技术？高分辨率熔解曲线(HRM，HighResolutionMelting)是传统的熔解曲线分析的延伸:•它要求特殊的荧光染料、高性能的荧光定量PCR仪器与专门的分析算法•分辨率高，可以区分一个碱基突变的多组核酸样本，可以区分野生型（纯合子）、突变型（纯合子），杂合子•使我们可以不必测序直接筛查PCR扩增产物中是否存在遗传学变异(SNPs,mutations)•与其它方法相比，具有高特异性、高灵敏度与方便快捷的优点；而且通量更高，单次成本更低！14MeltingCurvesTemperatureCGTA杂合子扩增两种同源双链两种异源双链CATG观察到的4种双链结构15野生型纯合子(同源双链）突变型纯合子（同源双链）杂合子（同源和异源双链）举例:人类LPLH3基因突变(SNPGT)72个样本,164bp基因分型高分辨率熔解分析16高分辨率熔解曲线的应用主要应用基因分型－突变筛查，如发现靶基因扩增产物中是否存在SNP或其它突变。基因扫描高分辨率熔解分析纯合子野生型(homoduplexes)纯合子突变型(homoduplexes)杂合子案例:LPLH3基因的突变(SNPGT)72样品，PCR产物大小164bp基因扫描实例–显著降低测序成本•MBL2基因序列变异分析(384个样本,扩增子长度219bp):4种昀常见的基因型在图像上被分为4组;少量样本呈现另外的3种遗传变异变异比例的定量分析•Example:CYP2C9,扩增子长度144bp,SNPC/TportionTallele50%,1:120%,1:514%,1:710%,1:104%,1:250%•发现新的SNP位点•已知SNP的检测分析•单倍型分析•杂合性丧失的筛查•种群中的等位优势分析•分类学物种鉴定•DNA遗传作图(发现携带高度可变座位的个体)•潜在易感基因的鉴别•DNA甲基化分析•RNA编辑…高分辨率熔解曲线的潜在应用21高分辨率熔解曲线SCI文献LightCycler480SCI22主要内容罗氏诊断简介实时荧光定量PCR及其基本应用罗氏cobasz480实时荧光定量PCR仪介绍仪热循环仪温度控制荧光采集荧光通道分析模式IVD通道UDF通道cobas z 480性能特点检测结果可靠，让您对实验充满信心1）温度均一性达+/-0.1℃，确保结果准确可靠•cobasz480开创性的使用了Therma-BaseTM半导体热循环技术，热量通过蒸发和冷凝传递加快加热和散热的速度，解决了传统半导体技术的边缘效应；•采用银质板座，导热能力优于其他金属；•采用热盖技术，使板紧贴加热模块；•实现了完美的定量准确性和重复性,并成功实现了昀新基因扫描技术(HRM)罗氏独特的Therma-Base结构有Therma-Base结构的热均一性明显优于没有的cobasz480AnalyzerStandardInstrumentThermalUniformityInstrumentComparison27对于96孔板的加热模式，存在着一定程度的温度不均一性半导体加热模块BLOCK边缘的传热不均一性96孔板的温度不均一性温控结构28cobasz480温控系统微孔板模块冷却装置热盖Therma-Base结构Peltier半导体加热单位温度高度均一性，孔间温度的精确度±0.1oC快速冷却和加热速度(Heating:4.4°C/s-Cooling:2.2°C/s)整个板精确的PCR结果29Therma-BaseTM结构——保证温度均一真空的气室，充满工作液内衬毛细管结构加热时：蒸发进入真空冷却时：随着热量释放而浓缩增大的表面积有利热量传递并去除了边缘效应液体传递保证均一性热量通过蒸发和冷凝传递加快加热和散热的速度散热鳍增加了散热的表面积散热有风扇辅助热盖：产生55Kg下压力，使板紧紧贴在加热模块上性能展示–数据质量不同仪器平台的性能比较–Cq值均一性0.160.56统计Cq值的昀大值减去昀小值，差值越小，均一性越好0.33性能展示–数据质量HRM性能比较–SNPClassIIAdd1(GT)/68bp/humangenomicDNA(10ng)HRM1.542Therma-Base±0.1oCcobas z 480性能特点一检测结果可靠，让您对实验充满信心其他厂家qPCR仪存在光程差，即光学边缘效应，需要加入ROX内参照染料来校正cobasz480实时荧光定量PCR仪　优化光学组件排列，解决了光学边缘效应2）先进的五棱镜腔光学系统消除边缘误差，保证结果真实可信•激发光经五角反射镜减少光程差，消除光学边缘效应，因此无需在反应体系中加入ROX荧光校正，保证了昀原始真实的分析数据来源•热盖的设计减少孔间光学信号交叉，邻近孔之间昀大交叉干扰0.02%。颜色补偿软件及滤光片减少同一孔内的多种荧光染料的信号干扰，实现多重PCR方式LightCycler®480光学系统多孔板热盖CCD相机光源检测滤镜激发滤镜光学组件光学组件光纤多孔板热盖参比通道光源CCD相机CCD相机光源检测滤镜激发滤镜光学组件光学组件光纤多孔板热盖参比通道对2倍浓度差异的分辨率明显用SYBRGreenI检测病毒DNA模板2倍梯度稀释，从1.00E6到977拷贝/反应3）优异的灵敏度，重复性和分辨率•可检测单拷贝基因•孔间检测的重复性（CV）≤0.15%•97%置信度区分1,000与2,000拷贝的差异cobas z 480性能特点一检测结果可靠，让您对实验充满信心cobasz480检测线性范围宽广质粒DNA以10倍梯度稀释，每个浓度9个重复，结果显示cobasz480具有宽广的动力学范围4）昀广的检测线性范围•可检测1－1010个拷贝cobas z 480性能特点一检测结果可靠，让您对实验充满信心cobas z 480性能特点二快速高效，节约工作时间•cobasz480升降温速度达4.4℃/秒，连续可调，是同类板式定量PCR中速度昀快的，可在60分钟内完成40个PCR循环•消除了加热模块的边缘效应，因此节省了ROX荧光校正的过程cobas z 480性能特点三同时满足开放性通道UDF及IVD罗氏原装试剂检测打造个性化的实验室PCR平台IVD工作流程•可配套罗氏肿瘤检测，以及罗氏的其他项目HPV，CT/NG•具有条形码管理，实现样品进结果出•默认程序，结果自动分析，自动打印报告，减少人为主观因素•可配套罗氏EGFR、BRAF、KRAS检测，以及罗氏的其他项目（HPV，CT/NG），泌尿生殖道感染患者淋球菌（NG）、沙眼衣原体（CT）...罗氏IVD实验室解决方案cobas®肿瘤学分子检测一个平台三种检测检测步骤cobas®产品疾病治疗药物样品制备cobas®DNAFFPE样品制备试剂盒扩增和检测cobas®EGFR41种突变检测非小细胞肺癌厄洛替尼（特罗凯）吉非替尼（易瑞沙）cobas®KRAS19种突变检测结直肠癌西妥西单抗（爱必妥）cobas®BRAFV600突变检测转移性黑色素瘤甲状腺瘤Zelboraf（威罗菲尼）结果分析和报告cobasz480PCR仪目前科室EGFR突变检测的特点外显子18Freq外显子19Freq外显子19Freq外显子19Freq外显子20Freq外显子21FreqG719A62390.8%Del622317.8%Del123870.3%Del135500.1%T790M62402.8%L858R622439.9%G719S62520.8%Del622510.2%Del62100.3%Del123860.1%S768I62410.7%L858R124290.1%G719C62530.6%Del123703.4%Del260380.2%Del135520.1%Ins123760.2%Del123822.5%Del135560.1%Del123850.1%Ins134280.2%Del123691.5%Del124220.2%Del124160.1%Ins123780.1%Del123841.3%Del62200.1%Del184270.1%Ins123770.1%Del62550.8%Del135510.1%Del235710.1%Ins135580.1%Del123830.7%Del123670.1%Del124030.1%Del126780.6%Del124190.2%Del62180.6%Del127280.2%Del62540.5%