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罗氏COBASTaqman病毒载量检测在肝炎诊疗中的应用COBASTaqMan肝炎病毒载量检测更灵敏，更准确肝炎治疗好搭档HBV感染是全球性卫生问题•33%的人在一生中会感染HBV;•成年感染者中5%-10%会转为慢性乙肝,全球约有3.5亿慢性HBV感染者;•每年,有100万人死于与乙型肝炎相关的肝硬化或者肝癌;•=每30s夺走一个生命•感染率最高的区域在亚洲,非洲.Lavanchy.JViralHepat2004;WorldHealthOrganization,2008;Elgouhari,CleveClinJMed2008ALT不同安全、疗效和耐药性的新药面世肝炎治疗的进展血清学荧光定量PCRDNA杂交Pegasys2005Telbivudine2006Lamivudine1998Adefovir2002Entecavir2005伴随着实验室评估和监测的改善治疗方案必须整合诊断、检测和治疗过程中的变化来制定全自动高灵敏实时荧光定量PCRTenofovir2008IFN1991不同的标志物提供不同的诊断以及治疗监控的信息诊断启动治疗鉴别初始应答预测治疗应答监测耐药证明持续应答HBsAgHBsAg定量抗-HBsHBeAg抗-HBe抗-HBcHBVDNAALTModifiedfromPawlotskyetal.Gastroenterol2008HBVDNA检测在CHB疾病管理中的意义评估疾病阶段预测疾病进程优化抗病毒治疗•开始治疗•治疗期间监测(“治疗路线图”)•监测耐药•治疗终点HBVDNA检测贯穿于乙肝治疗的整个过程高灵敏、准确可靠的检测结果才能有效地指导临床治疗启动治疗60IU/mL完全应答2000IU/mL不充分应答60-2000IU/mL部分应答Week12:鉴别原发性无应答HBV-DNA水平较基线水平下降幅度1log/mlWeek24:疗效早期预测HBVDNA–启动治疗、鉴别初始应答、预测治疗应答由美国坦福大学医学中心Keeffe教授（专家组）提供KeeffeetalClinGastroenterolHepatol2007继续治疗监测HBV-DNA/6个月增加基因变异特点不同药物治疗监测HBV-DNA/3个月增加/更换有效的药物治疗监测HBV-DNA/3个月●正确选择治疗的时机，尤其是对肝硬化低病载的患者●评价疗效更准确●决定治疗方案（药物的剂量？单药还是联合？疗程？)●监测耐药，及时改变策略（换药？联合？）●谨慎合理停药，减少复发高灵敏，准确可靠的HBVDNA检测对临床治疗至关重要国产PCR试剂外标法(标准曲线法)10710610510410?10?外标法的缺点：未考虑标本的个体差异、不同管间扩增效率的差异、不同批次操作者主观因素及污染对结果的影响未对低于104扩增进行定标，因此无法准确判读低水平特异性扩增无溯源数据罗氏cobasTaqman核酸检测提供的不仅仅是全自动更是准确可靠的结果AmpErase防污染酶闭管进，闭管出仪器自带紫外灯消毒高保守扩增片段的选择，防止漏检内标定量法，定量更准确罗氏独有的内部标准品定量方法消除管间差异内部质控品无需外部定标避免额外定标产生的损耗内部标准品（QuantificationStandards,QS）:将已知浓度的人工构建核酸，加入至每个样本管中，与样本一同提取、扩增；根据内标的Ct值对样本定量样本扩增曲线内标扩增曲线TheCOBAS®TaqMan®HBVTesttargetstheprecore/coreregion•Highlyconservedinallgenotypes•Avoidscommonmutations•YMDD•Doublecorepromotermutations•Precoremutation•Clinicallyvalidated***HuntC.M.,etal.(2000).Hepatology31,1037–1044.ChoiceofPCRtargetisfundamentaltoassayperformance***Target高保守扩增片段的选择，防止漏检COBAS®AmpliPrep/COBAS®TaqMan48/96全球第一台全自动实时荧光定量PCR平台样品进--结果出自动化只为提供更准确的结果COBAS®TaqMan®肝炎核酸检测提供卓越的检测性能COBASTaqmanHBVDNACOBASTaqmanHCVRNA灵敏度20IU/mL15IU/mL线性范围20–1.7x108IU/mL15–1.0x108IU/mL特异性100%100%覆盖基因型A-H;pre-coremutantsGt1-6COBAS®TaqMan®肝炎病毒载量检测更灵敏，更准确肝炎治疗好搭档HBVDNA检测性能比较cobasTaqman检测提供更卓越的性能COBASTaqman检测普通国产检测COBASTaqman优越性灵敏度20IU/mL500-1000IU/mL对低浓度样本准确检出，更准确反映应答情况线性范围20–1.7x108IU/mL1000–1x108IU/mL宽泛的线性范围，覆盖大部分临床样本，减少二次检测定量方法内部标准品法外部标准品法避免PCR反应管间差异，确保定量准确自动化全自动手工操作提高检测重复性；避免污染，杜绝假阳性可溯源性WHO标准品不明确确保结果准确性COBASTaqman检测普通国产检测COBASTaqman优越性灵敏度15IU/mL500-1000IU/mL对低浓度样本准确检出，更准确反映应答情况线性范围15–1.0x108IU/mL1000–1x106IU/mL宽泛的线性范围，覆盖大部分临床样本，减少二次检测定量方法内部标准品法外部标准品法避免PCR反应管间差异，确保定量准确自动化全自动手工操作提高检测重复性；避免污染，杜绝假阳性可溯源性WHO标准品不明确确保结果准确性HCVRNA检测性能比较cobasTaqman检测提供更卓越的性能ChinaInvestigatorMulticentreEvaluationSTUDYAPASLPosterCHIMESTUDY--比较罗氏HBVDNA定量检测与2种国产试剂北京大学肝病研究所北京大学基础医学院首都医科大学附属友谊医院上海交通大学附属瑞金医院APASLPoster2011华西医院采用CAP/CTMHBV检测20例治疗48周普通PCR报告HBVDNA1000copies/ml样本的结果分析20例患者组成特点--9例服用ETV、11例服用ADV（48周）--10例大三阳、8例小三阳患者、2例小二阳患者检测试剂病例数HBVDNA分布范围国产HBV20例1000copies/mlCAP/CTMHBV11例8例*1例TargetNotDetected103~104copies/ml104~105copies/ml*包括1例服用ETV患者普通PCR法“假阴性”率高达45%(9/20)COBASTaqmanHBVDNA更准确监测疗效及判断治疗终点•全球有2亿人感染HCV•流行率2.2–3.0%1–3•1.7亿慢性携带者2•HCV相关的肝脏疾病每年夺取超过25万人的生命1•~80%的感染者没有任何的临床症状5,6•40–85%的感染者未得到诊断7–12HCV临床背景1Chevaliez.ClinMicrobiolInfect2011;2WHO2003;3Lavanchy.LiverInt2009;4Wiessingetal.Eurosurveillance2008;5Hoofnagle.Hepatology2002;6Lemonetal.Field’sVirology2007;7://中国丙肝临床报告病例逐年递增中国卫生部公告.庄辉.2012世界肝炎日全国丙肝专题会议.2114539380529277068192378108446131849153039173872020000400006000080000100000120000140000160000180000200320042005200620072008200920102011中国目前约有1000万例丙肝感染者HCV临床背景65–75%感染发展为慢性丙肝，继而导致肝硬化，肝衰竭及肝细胞癌血液肝组织病毒复制病毒持续存在慢性HCV感染急性HCV感染Initialinfection病毒清除自限性感染免疫应答终末期肝病肝细胞癌WHO2003.肝硬化HCV基因型•HCV病毒有6种主要的基因型•每种基因型有各种不同的亚型•基因型的分布有明显的地域特征•基因分型非常重要，不同基因型的疗效和疗程均不同Hoofnagle.Hepatology2002;Lemonetal.Field’sVirology2007.丙型肝炎实验室检测指标•抗-HCV高危人群筛查及HCV感染者的初筛非保护性抗体，转阴与否不作为抗病毒疗效的指标•HCVRNA--诊断疾病及治疗管理最关键的指标病毒感染、具有传染性和病毒复制的标志直接代表病毒血症的水平即使体内HCV含量很低，也可通过realtimeRT-PCR方法检测到HCVRNA较抗-HCV更早出现，缩短窗口期缩至12天左右•IL-28B,Genotype,ALT……HCVRNA核酸的检测是目前指导丙肝诊疗的最关键指标！！！RGT个体化治疗策略——科学的疗效评估和管理体系RGT——ResponseGuideTherapy应答指导的治疗策略——在疗程中根据患者的病毒学应答对治疗方案做出系统化的评价和管理丙型肝炎RGT策略对关键时间节点治疗应答的定义病毒学反应定义RVR治疗4周时，HCVRNA转阴(50IU/mL)EVRcEVR(完全EVR)治疗4周时，HCVRNA阳性，但12周时转阴（低于检测低限50IU/mL）pEVR(部分EVR)治疗12周时，HCVRNA阳性，但相对于治疗前基线下降≥2log10非EVR治疗12周时，HCVRNA下降2log10值RVR(RapidVirusResponse,快速病毒学应答)EVR(EarlyVirusResponse,早期病毒学应答)临床医生需要符合现有指南要求的敏感的HCVRNA检测方法1.CraxiA,etal.JHepatol2011;55:245;2.OmataM,etal.HepatolInt2012;6:409;3.GhanyM,etal.Hepatology2009;49:1335.实时荧光定量PCR检测具有灵敏性高、特异性强、精确度高、重复性好、动态监测范围广的特点，这一检测方法将会使用在亚洲国家的临床实践中APASL指南2高灵敏性检测方法（检测限LoD10–50IU/mL）适用于治疗监测AASLD指南3治疗前评估:采用敏感的检测方法，理想情况下采用实时荧光定量PCR进行HCVRNA检测和定量(检测限LoD˂50IU/mL)疗效监测:以实时荧光定量PCR为基础的检测方法（检测限LoD10–20IU/mL）是最好的监测工具EASL指南1LoD=检测限;PCR=聚合酶链式反应;APASL=亚太肝脏学会;AASLD=美国肝脏协会cobasTaqman检测普通检测灵敏度15IU/mL500-1000IU/mL正确的检测结果对治疗至关重要cobasTaqmanHBVDNA检测更准确判断治疗起点，监测应答、预测疗效、监测耐药及判断停药时机cobasTaqmanHCVRNA检测确保更好执行RGT总结COBAS®TaqMan®肝炎病毒载量检测更灵敏，更准确肝炎治疗好搭档