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发育生物学实验主讲教师：薛秀花北京师范大学生命科学学院2016年一、拟南芥简介二、实验技术---农杆菌介导拟南芥转化实验1拟南芥室内培养观察及农杆菌转化拟南芥农杆菌介导拟南芥的转化实验目的1、学习真核生物的转基因技术及农杆菌介导的转化原理2、掌握农杆菌介导转化拟南芥的实验方法3、了解拟南芥的生理特点及在基因工程实验中应用。实验材料农杆菌GV3101重组菌株，重组双元表达载体pCAMBIA1300，拟南芥实验试剂LB液体培养基，Kan（卡那霉素），Rif（利福平）；转化介质：MS培养基、5%蔗糖，0.03%SilwetL-77，KOH调pH5.7。实验原理植物遗传转化农杆菌介导法基因枪法PEG诱导原生质体电穿孔法操作简单，易造成原生质体损伤双子叶植物无宿主限制，技术限制原生质体培养农杆菌介导拟南芥的转化浸花法叶盘法原生质体共培养创伤植物感染法实验原理农杆菌介导拟南芥的转化农杆菌的感染与生存技术应用一种方便，高效的植物转基因方法，多用于转化双子叶植物，经过改进后也逐渐用于单子叶植物的转化。实验原理农杆菌介导拟南芥的转化McKinneyetal2001拟南芥转基因技术：InplantaAgrobacterium-mediatedgenetransferbyinfiltrationofadultArabidopsisthalianaplants.CRAcadSciSerIIISciVieLifeSci1、影响因素MSsalts,hormone,ODofbacteria,vacuum,etc.无影响Planthealth非常重要因素2、转化效率：1%3、转化步骤a、GrowhealthyArabidopsisplantsuntiltheyareflowering.8、高压灭菌（1）MS培养基（121ºC,15分钟）。（2）玻璃烧杯：200ml2个、500ml1个、50ml的三角瓶20个、培养皿8个（4培养皿装滤纸，6片/平皿）。（3）枪型镊子、剪刀各2把。（4）1ml、200ul、20ul的tip头各1盒。(5)无菌水500～700mL*2拟南芥转基因技术：McKinneyetal20011、影响因素MSsalts,hormone,ODofbacteriaetc.2、3、4、作业预习：烟草叶片愈伤组织诱导和器官发生课后各组查阅资料，设计3个不同浓度的NAA和6-BA，用于诱导不同器官，如芽、根、叶等