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第六章免疫细胞化学技术（免疫组化）(immunocytochemistry)是利用免疫反应来定位组织和细胞中特异大分子的一类技术第一节免疫细胞化学原理★第二节免疫细胞化学方法免疫细胞化学技术一、免疫反应的特异性二、免疫细胞化学反应三、抗原四、抗体五、标记物及其在光镜和电镜下可见性第一节免疫细胞化学原理免疫反应的特异性表现在：抗原作为一类结构复杂的大分子能刺激机体产生对其特异的抗体并与抗体发生反应抗体针对某种抗原分子而产生的，特异地识别该抗原并与其结合一、免疫反应的特异性免疫细胞化学反应的原理：把组织细胞中的特异分子作为抗原,用在显微镜下可见的标记物标记特异抗体(或者标记抗原抗体复合物)使特异的免疫化学反应具有可见性,从而间接地显示抗原,达到在细胞或细胞器水平定位特异分子的目的二、免疫细胞化学反应组织抗原抗体标记物标记抗体1荧光2酶3亲和技术4金标抗原免疫细胞化学反应过程为：＋标记物间接法直接法两种免疫反应方法抗原：凡能刺激机体产生抗体并能与抗体特异结合的物质称为抗原抗原性：物质所具有的这种特性称为抗原性三、抗原细胞中具有抗原性的化学成分有：蛋白质多肽脂蛋白多糖脂多糖糖蛋白核蛋白这些生物大分子都能用免疫细胞化学技术检测吗?从生物学功能来看都包括了哪些物质?酶、受体、抗体、细胞外基质激素、细胞结构蛋白、病原体等具有抗原性的物质包括：四、抗体CCFcFabNNNNCCFab片段具有抗体活性，决定某种抗体与抗原结合的能力和特异性Fc片段决定该抗体本身作为抗原刺激机体产生抗体的能力和特异性决定其本身抗原性抗体的结构免疫细胞化学技术中所用的抗体有两种：抗血清—多克隆抗体，是用提纯的抗原免疫动物后从动物血清制备得到的单克隆抗体—是指由单个产生特异抗体的Ｂ淋巴细胞分化增殖形成的细胞克隆产生的抗体1免疫荧光技术2免疫酶技术3免疫亲和技术4胶体金技术五、标记物及其在光镜和电镜下的可见性标记物使抗体或抗原抗体复合物在各种显微镜下可的物质免疫荧光技术将荧光素作为标记物使组织细胞中形成的抗原抗体复合物在荧光显微镜下可见，从而显示抗原物质的定位（一）免疫荧光技术１.异硫氰酸荧光素２.四乙基罗达明３.四甲基异硫氰酸罗达明４.藻红蛋白▲分子量不同▲最大吸收光谱不同▲最大发射光谱不同▲与蛋白结合方式不同▲呈现不同的荧光：黄绿色荧光橙色荧光橙红色荧光等荧光素能产生荧光并能作为染料的一类化合物荧光：在激发光（荧光显微镜提供）的照射下，能发出较激发光波长更长的可见光并随照射停止而消失荧光显微镜：荧光显微镜的光源提供各种激发光，如紫外光、蓝紫光（有不同的波长范围）使受检标本内的荧光物质发光是将酶作为标记物使组织细胞中形成的抗原抗体复合物得到标记，再通过酶细胞化学反应产生显微镜下可见的显色物质，间接显示抗原物质的定位（二）免疫酶技术1.反应产物定位准确，颜色对比清晰2.反应后标本材料可长期保存3.能用于电镜观察免疫酶技术优点：酶抗原一抗二抗酶标二抗酶—抗酶抗体复合物抗酶抗体酶标抗体法抗酶抗体法复合物法酶标记的三种形式用交联剂将酶与抗体联接成酶标抗体用于直接法和间接法酶标抗体法用酶免疫动物获得抗酶抗体，通过二抗的桥梁作用把抗酶抗体连接在一抗上,再加入酶及其底物，达到用酶标记抗原抗体反应的效果由于产生抗酶抗体的动物与产生第一抗体的动物是同一种属，两种抗体具有相同的免疫源性，所以在反应中本来针对一抗的二抗也能与抗酶抗体结合抗酶抗体法或称酶桥法先获得抗酶抗体并将抗酶抗体与酶一起预先制成酶－抗酶抗体复合物在反应中，由二抗的桥梁作用把复合物与一抗连接在一起最后加入底物，从而达到用酶标记抗原抗体反应的效果优点:1、抗体活性高2、灵敏度高酶－抗酶抗体复合物法常用的标记酶：1.辣根过氧化物酶2.碱性磷酸酶常用的两种方法是：（1）过氧化物酶标记抗体法（2）过氧化物酶-抗过氧化物酶复合物法（Peroxidase-Antiperoxidase,PAP）一抗与组织抗原特异结合二抗又将PAP复合物与第一抗体连接在一起然后加入HRP的天然底物H2O2和捕捉底物DAB光镜-棕黄色反应产物(组织抗原的定位)１.辣根过氧化物酶（hoseradishperoxidase,HRP）２.碱性磷酸酶（Alkalinephosphotase,AKP）碱性磷酸酶技术常用的两种方法：(1)碱性磷酸酶标记抗体(2)碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶复合物法（APAAP）（Alkalinephosphotase－Antialkalinephosphotase）APAAP法的原理：以碱性磷酸酶为标记物,再通过与其底物的细胞化学反应使抗原抗体反应可见常用的底物是萘酚,偶联剂是固蓝、固红等常用于标记的酶：1.辣根过氧化物酶2.碱性磷酸酶利用两种物质高度亲和力而互相结合定位特异分子亲和物质具有多价能力的物质，与亲和物质有高度亲和力又能与抗体、蛋白质及各种标记物(荧光素、酶、胶体金等)结合最常用的亲和物质系统：1、生物素（biotin）与亲和素（avidin）两者结合能力为不可逆的2、葡萄球菌A蛋白与免疫球蛋白IgG（三）亲和细胞化学技术(1)标记亲和素－生物素技术（Labeledavidinbiotin,LAB）(2)桥式亲和素－生物素技术（Bridgedavidinbiotin,BAB）(3)亲和素－生物素-酶复合物技术（Avidin-biotinperoxidasecomplexmethod，ABC）1.生物素系统标记技术的基本方法生物素化酶生物素化抗体亲和素—生物素—酶复合物生物素亲和素生物素与抗体共价偶联后加入与过氧化物酶（或荧光素）结合的亲和素利用生物素－亲和素之间的结合，间接显示组织细胞中的抗原标记亲和素生物素法利用亲和素为桥梁连接生物素化的抗体和生物素化的酶桥式亲和素－生物素法亲和素－生物素-酶复合物技术亲和素与生物素偶联的过氧化物酶组合成亲和素－生物素－酶复合物①特异性抗体（一抗）先与组织细胞中的抗原结合，②生物素化抗体（二抗）再与一抗结合③复合物与生物素化抗体结合①→③→②→葡萄球菌A蛋(StaphylocalproteinA,SPA)◆是金黄色葡萄球菌细胞壁含有的一种蛋白简称为A蛋白或蛋白A◆SPA能与人及多种哺乳动物血清中IgG呈非特异性结合又能与标记物结合经标记的SPA可代替相应标记的二抗2.葡萄球菌A蛋白与IgG系统亲和素（四）免疫胶体金技术免疫胶体金技术是以光镜和电镜下都可见的胶体金作为抗体或Ａ蛋白的标记物，间接显示组织细胞中特异分子的技术胶体金颗粒大小一般在5--60nm胶体金颗粒表面带负电荷，蛋白质表面带正电荷，蛋白质在等电点或偏碱时被吸附于金颗粒表面,形成一个蛋白层阻止了金颗粒的相互接触，使免疫金处于稳定状态胶体金对蛋白质的标记:胶体金A蛋白1.免疫金法※(ImmunogoldstainingIGS)2.免疫金银法（Immunogoldsilverstaining,IGSS)3.彩色免疫金银法（ColouredIGSS,CIGSS）免疫胶体金技术常用方法免疫金法一抗与抗原结合金标抗体或金标A蛋作为二抗与抗原抗体复合物结合抗原抗体反应部位在光镜下呈现红色，在电镜下呈高电子密度1、采用不同大小的金颗粒(通常5-20nm)标记不同抗体或A蛋白，达到双重甚至多重标记定位多种抗原的目的2、金颗粒便于计数，可对反应作定量分析3、可用于透射、扫描电镜和冷冻蚀刻标本可将结果与光镜免疫金技术结果进行对照免疫交体金体金优点：免疫细胞化学技术是在原位检测细胞中抗原基本过程:抗原固定↓抗原与抗体结合反应↓标记系统反应第二节免疫细胞化学方法一、样品制备二、抗体准备三、基本实验过程四、一些关键问题固定光镜醛类固定,常规石蜡包埋和切片(冷冻切片→化学固定→免疫细胞化学反应)电镜4％多聚甲醛为首选固定剂(多聚甲醛混合0.05-0.5%戊二醛)包埋前技术免疫细胞化学反应在未经包埋的组织片上进行包埋后技术免疫细胞化学反应在超薄切片上进行一、样品制备抗体制备：特异抗体主要从购买获得(也可自行制备特异抗血清甚至单克隆抗体)抗体标记:直接法对每种一抗进行标记，很少用间接法对二抗进行标记(标记二抗使用十分普遍)标记抗体的方法：1.荧光素标记抗体方法2.酶标记抗体3.生物素化抗体4.胶体金标记抗体或A蛋白二、抗体准备免疫细胞化学方法有:直接法、间接法间接法中有:二抗、三抗或复合物标记系统有:荧光素、酶、亲和素胶体金观察方法有:荧光显微镜、普通光镜、电镜三、基本实验过程切片,丙酮固定，石蜡切片脱蜡复水1%H2O2/甲醇阻断内源性过氧化物酶正常羊血清(二抗的正常血清)1:20室温封闭适当稀释一抗(兔抗体)孵育适当稀释二抗(羊抗体)孵育适当稀释兔PAP复合物孵育0.04%DAB+0.03%H2O2显色，充分水洗终止反应苏木素衬染,封片光镜观察棕褐色阳性反应沉淀物过氧化物酶－抗过氧化物酶复合物法（PAP法）80nm左右厚度超薄切片置于镍网上1-10%H2O2蚀刻1%BSA室温封闭适当稀释一抗孵育室温1%BSA室温封闭适当稀释的10-20nm金标A含2%戊二醛/3%多聚甲醛固定铀、铅染色电镜观察高电子密度的金颗粒电镜包埋后胶体金细胞化学反应(一)样品固定：抗原和结构的保存(二)抗体、标记物以及方法选择：单抗、多抗种属关系(三)通透处理：蛋白酶、表面活性剂(四)对照设定：阴性、阳性、自身对照(五)非特异反应的鉴别和抑制：封闭、稀释阻断四、一些关键问题第六章重点一、免疫细胞化学反应原理把组织细胞中的特异分子作为抗原,用在显微镜下的可见标记物(或标记抗原抗体复合物)标记特异抗体,使特异的免疫化学反应具有可见性从而间接地显示抗原,达到在细胞或细胞器水平定位特异分子的目的二、简述免疫细胞化学的直接法和间接法直接法：组织抗原直接与标记的特异抗体反应间接法：抗原与未标记的特异抗体（一抗）反应一抗再作为抗原与标记的第二抗体反应三、何谓标记物，包括哪几种？标记物：使抗体或抗原抗体复合物在各种显微镜下可见的物质包括：1、免疫荧光技术2、免疫酶技术3免疫亲和技术4、胶体金技术四、简述四、简述APAAPAPAAP法的原理法的原理（（AAlkalinelkalinepphosphotasehosphotase－－AAntintiaalkalinelkalinepphosphotasehosphotase））碱性磷酸酶碱性磷酸酶--抗碱性磷酸酶复合物法抗碱性磷酸酶复合物法APAAPAPAAP法的原理是法的原理是以碱性磷酸酶为标记物以碱性磷酸酶为标记物,,通过与通过与其底物的细胞化学反应使抗原抗体反应可见其底物的细胞化学反应使抗原抗体反应可见五、简述PAP法（Peroxidase-Antiperoxidase,PAP）过氧化物酶-抗过氧化物酶复合物法一抗与组织抗原特异结合二抗又将PAP复合物与一抗连接在一起然后加入HRP的天然底物H2O2和捕捉底物DAB光镜-棕黄色反应产物(组织抗原的定位)电镜-与锇酸反应，呈高电子密度锇黑（超微结构定位抗原）