第六章-微生物生长

第六章微生物的生长与环境因子MicrobialGrowth生长——微生物细胞吸收营养物质，进行新陈代谢，当同化作用异化作用时，生命个体的重量和体积不断增大的过程。繁殖——生命个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。发育——从生长到繁殖，是生物的构造和机能从简单到复杂、从量变到质变的发展变化过程，这一过程称为发育。第一部分：微生物的生长生长是一个逐步发生的量变过程，繁殖是一个产生新的生命个体的质变过程。个体生长与群体生长个体生长——微生物细胞个体吸收营养物质，进行新陈代谢，原生质与细胞组分的增加为个体生长。群体生长——群体中个体数目的增加。可以用重量、体积、密度或浓度来衡量。（由于微生物的个体极小，所以常用群体生长来反映个体生长的状况）个体生长个体繁殖群体生长群体生长=个体生长+个体繁殖通常把一个细胞分裂成两个细胞所需要的时间，称为代时。一个微生物细胞合适的外界条件，吸收营养物质，进行代谢。如果同化作用的速度超过了异化作用个体的生长原生质的总量（重量、体积、大小）就不断增加如果各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就会发生繁殖，引起个体数目的增加。群体内各个个体的进一步生长群体的生长☆无分支单细胞微生物主要包括细菌和酵母菌其群体生长是以群体中细胞数量的增加来表示的，☆由一个细菌分裂成为两个细菌的时间间隔称为世代，一个世代所需的时间就是代时（Ｇenerationtime,G），代时也就是群体细菌数目扩大一倍所需时间，有时也称为倍增时间。☆右图表示的是一个细菌经过若干代分裂后的情况。右图可见，每经过一个代时，细菌数目就增加一倍，呈指数增加，因而被称为指数生长，这就是菌群体生长的特征。细菌的群体生长特征一些细菌的代时菌名培养基培养温度代时E.coli（大肠杆菌）肉汤37℃17minE.coli牛奶3712.5Enterobacteraerogenes（产气肠细菌）肉汤或牛奶3716~18E.aerogenes组合3729~44B.Cereus（蜡状芽孢杆菌）肉汤3018B.thermophilus（嗜热芽孢杆菌）肉汤5518.3Lactobacillusacidophilus（嗜酸乳杆菌）牛奶3766~87Streptococcuslactis（乳酸链球菌）牛奶3726S.lactis乳糖肉汤3748Salmonellatyphi（伤寒沙门氏菌）肉汤3723.5Azotobacterchroococcum（褐球固氮菌）葡萄糖25344~46Mycobacteriumtuberculosis（结核分枝杆菌）组合37792~93Nitrobacteragilis（活跃硝化杆菌）组合271200第一节微生物纯培养分离及生长测定方法一、获得纯培养的方法纯培养(pureculture)微生物学中把从一个细胞或一群相同的细胞经过培养繁殖而得到的后代,称纯培养.（1）液体稀释法（2）平板划线分离法（StreakPlate）（3）平板涂布分离法（SpreadPlate）（4）选择性培养分离法（5）单细胞（单孢子）分离法首先将待分离的样品进行连续稀释,目的是得到高度稀释的效果,使一支试管中分配不到一个微生物.如果经过稀释后的大多数试管中没有微生物生长,那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是由一个微生物个体繁殖而来的纯培养物.这种方法适合于细胞较大的微生物.（1）液体稀释法（2）平板划线分离法（StreakPlate）特点：快速、方便。分区划线（适用于浓度较大的样品）连续划线（适用于浓度较小的样品）Aninoculatingloopisusedtothinoutorganismsonthesurfaceoftheagar.（3）平板涂布分离法（SpreadPlate）简单易行，但易造成机械损伤Liquidspecimenisspreadonthesurfaceofsolidagarwithasterilebentglassrod.（4）选择性培养分离法为了从混杂的微生物群体中分离出某种微生物，可以根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养的方法进行分离。＊利用选择培养基进行直接分离＊富集培养（5）单细胞（单孢子）分离法采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养的方法。该方法要在显微镜下进行。毛细管法：用毛细管提取微生物个体，适合于较大微生物。显微操作仪：用显微针、钩、环等挑取单个细胞或孢子以获得纯培养。小液滴法：将经过适当稀释后的样品制成小液滴，在显微镜下选取只含一个细胞的液滴来进行纯培养物的分离。二、微生物生长量的测定方法（一）微生物细胞数目的检测法1。总菌数的测定（计数器直接计数，染色涂片计数，比浊法）2。活菌数的测定（平板计数法、液体稀释法、膜过滤法）（二）微生物生长量的测定1。直接法(干重法，体积法)2。间接法（比浊法，碳、氮含量法，DNA测定法等）1.血球计数板法2.涂片染色法应用：可同时计数不同微生物的菌数，适于土壤、牛奶中细菌计数。方法：用镜台测微尺计算出视野面积；取0.1ml菌液涂于1cm2面积上，计数后代入公式：每ml原菌液含菌数=视野中平均菌数×涂布面积/视野面积×10×稀释倍数4。薄膜过滤计数法常用该法测定含菌量较少的空气和水中的微生物数目。将定量的样品通过薄膜（硝化纤维素薄膜、醋酸纤维薄膜）过滤，菌体被阻留在滤膜上，取下滤膜进行培养，然后计算菌落数，可求出样品中所含菌数。5.干重法将一定量的菌液中的菌体通过离心或过滤分离出来,然后烘干(干燥温度可采用105℃、100℃或80℃)、称重。一般干重为湿重的10%—20%，而一个细菌细胞一般重约10-12—10-13g。该法适合菌浓度较高的样品。举例：大肠杆菌一个细胞一般重约10–12~10–13g，液体培养物中细胞浓度达到2×109个/ml时，100ml培养物可得10~90mg干重的细胞。6.比浊法原理：是在一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正比，即与光密度成正比，菌数越多，光密度越大。因此，借助于分光光度计，在一定波长下测定菌悬液的光密度，就可反应出菌液的浓度。特点：快速、简便；但易受干扰。7.生理指标法测含氮量蛋白质是细胞的主要物质，含量稳定，而氮是蛋白质的主要成分，通过测含氮量就可推知微生物的浓度。一般细菌含氮量为干重的12.5%，酵母菌为7.5%，霉菌为6.0%，根据一定体积培养液中的含氮量再乘以6.25，就可测得粗蛋白的含量。其他方法含碳、磷、DNA、RNA、耗氧量、消耗底物量、产二氧化碳、产酸、产热、粘度等，都可用于生长量的测定。第二节微生物的生长曲线一、微生物培养：研究群体生长规律，首先应对微生物进行培养。培养的方法有：分批培养和连续培养这两种方法既可用于纯种培养，也可用于混合培养。1分批培养（batchculture）：分批培养（batchculture）：将微生物置于一定容积的定量的培养基中培养，培养基一次性加入。不再补充和更换，最后一次性收获。•将少量细菌接种到一种新鲜的、定量的液体培养基中进行分批培养，定时取样计数，以细菌个数或细菌数的对数为纵坐标，以培养时间为横坐标，连接坐标纸上各点成一条曲线即细菌的生长曲线。•生长曲线可以细分为六个阶段、四个时期：延迟期（停滞期）、加速期、对数生长期、减速期、稳定期（静止期）、衰亡期（或死亡期）。生长曲线第二节细菌的群体生长繁殖由于采用活菌计数比较麻烦，并要求严格进行操作，否则不易得到准确的结果，重复性也差，因此在实际工作中多采用分光光度计测定OD值的方法绘制细菌的生长曲线。典型的生长曲线（Growthcurve）延滞期对数期稳定期衰亡期时期的划分：按照生长速率常数（growthraceconstant）不同加速期减速期一条典型的生长曲线至少可以分为迟缓期，对数期，稳定期和衰亡期四个生长时期迟缓期(Lagphase)：将少量菌种接入新鲜培养基后，在开始一段时间内菌数不立即增加，或增加很少，生长速度接近于零。也称延迟期、适应期。迟缓期的特点：分裂迟缓、代谢活跃细胞形态变大或增长，例如巨大芽孢杆菌，在迟缓期末，细胞的平均长度比刚接种时长6倍。一般来说处于迟缓期的细菌细胞体积最大。细胞内RNA，尤其是rRNA含量增高，合成代谢活跃，核糖体、酶类和ATP的合成加快，易产生诱导酶。对外界不良条件反应敏感。细胞处于活跃生长中，只是分裂迟缓在此阶段后期，少数细胞开始分裂，曲线略有上升。迟缓期出现的原因：微生物接种到一个新的环境，暂时缺乏分解和催化有关底物的酶，或是缺乏充足的中间代谢产物等。为产生诱导酶或合成中间代谢产物，就需要一段适应期。调整代谢◆菌种：繁殖速度较快(世代时间短)的菌种的延迟期一般较短；◆接种物菌龄：用对数生长期的菌种接种时，其延迟期较短，甚至检查不到延迟期；◆接种量：一般来说，接种量增大可缩短甚至消除延迟期（发酵工业上一般采用1/10的接种量）；◆营养：培养基成分◇在营养成分丰富的天然培养基上生长的延滞期比在合成培养基上生长时短；◇接种后培养基成分有较大变化时，会使延滞期加长，所以发酵工业上尽量使发酵培养基的成分与种子培养基接近。★影响延迟期长短的因素：认识延迟期的特点及形成原因对实践的指导意义：◆在工业上需设法尽量缩短延迟期；采取的缩短lagphase的措施有：①增加接种量；（群体优势----适应性增强）②采用对数生长期的健壮菌种；③尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大；④通过遗传学方法改变种的遗传特性使迟缓期缩短；2、对数期（指数期）logphase细菌生长速度达到最大，数量以几何级数增加。特点：（1）细菌迅速分裂，菌数按几何级数增加；（2）世代时间最短，而且恒定；（3）生长速度最高而且恒定；（4）代谢活力强无死亡；（5）菌体整齐，体积恢复到原来大小；（6）对环境敏感，生理性状及菌体成分较一致延长措施：定时定量加入营养物质，同时排出代谢产物，或使用连续培养。应用意义：①由于此时期的菌种比较健壮，生产上用作接种的最佳菌龄；②发酵工业上尽量延长该期，以达到较高的菌体密度③食品工业上尽量使有害微生物不能进入此期④是生理代谢及遗传研究或进行染色、形态观察等的良好材料。③.静止期（stationaryphase）又称：稳定期或最高生长期特点：①新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等，微生物的生长速率处于动态平衡，培养物中的活细胞数目达到最高值。②细胞分裂速度下降，开始积累内含物，产芽孢的细菌开始产芽孢。③此时期的微生物开始合成次生代谢产物，对于发酵生产来说，一般在稳定期的后期产物积累达到高峰，是最佳的收获时期。若目标是菌体，则在静止期初期就要及时收获菌体。产生原因：•营养物浓度的降低•有害代谢废物的积累（酸、醇、毒素等）•物化条件（pH、氧化还原势等）的改变;•溶解氧供应不足应用意义：发酵生产形成的重要时期（抗生素、氨基酸等），生产上应尽量延长此期，提高产量，措施如下：•补充营养物质（补料）•调pH•调整温度④.衰亡期（declinephase）特点：①细胞死亡数增加，死亡数大大超过新增殖的细胞数，群体中的活菌数目急剧下降，出现“负生长”。②细胞进行内源性呼吸（因为营养缺乏），出现多形态、畸形或衰退形，芽孢开始释放。③因菌体本身产生的酶及代谢产物的作用，使菌体死亡。衰亡期比其他各时期时间长，它的长短也与菌种和环境条件有关。产生原因：生长条件的进一步恶化，使细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，继而导致菌体的死亡•由于污水大都是连续排放且流量波动很大，这时间歇反应器（SBR）至少需要两个或多个池，污水连续按序列进入每个反应器，它们运行时的相对关系是有次序的，也是间歇的；二是每个SBR的运行操作，在时间上也是按序列排列的、间歇的，一般可按运行次序分为五个阶段，即进水（fill）、反应（react）、沉淀（settle）、出水（draw）和闲置（idle）等五个基本过程。活性污泥中的序批式间歇曝气器三.丝状微生物的群体生长（不讲）丝状微生物的纯培养采用孢子接种，在液体培养基中震荡培养或