微生物学课件-5微生物生长繁殖与控制

第七章微生物生长繁殖及其控制MicrobialGrowth，ReproductionandEnvironments第一节微生物的个体与群体生长和繁殖MicrobialGrowthandReproduction微生物的生长与繁殖微生物生长(Growth)：-----个体生长是指细胞物质有规律地、不可逆增加的生物过程。微生物繁殖(Reproduction)：----个体繁殖是微生物生长到一定阶段由于细胞内各种细胞结构的复制和重建导致产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的整个生物学过程。微生物的个体生长和群体生长个体生长：一个微生物个体应具备生长和繁殖的全能性。单细胞微生物如细菌、酵母菌等，一个细胞就是一个个体。单细胞微生物的生长即使细胞的增大，但这种过程在适宜的环境中，一种微生物如大肠杆菌（E.coli），从一个个体（细胞）出发，通过生长与繁殖，逐渐形成细胞总生物质量(biomass)与数量相应增加的群体，这种现象与过程称为群体生长。群体生长是微生物个体生长与个体繁殖持续交替进行所导致的结果。因此，群体生长是以微生物的个体生长与繁殖为基础的。一、微生物的个体生长与繁殖1、细菌的个体生长与繁殖单细胞原核微生物持续生长直至分裂成两个新的细胞，这个过程称为二等分裂。杆状细菌如大肠杆菌在培养过程中，能观察到细胞延长至大约为细胞最小长度的2倍时，处于细胞中间部位的细胞膜和细胞壁从两个相反的方向向内延伸，逐渐形成一个隔膜，直至2个子细胞被分割开，最终分裂形成2个子细胞。细胞壁合成模式2、细菌拟核DNA的复制与分离细菌的拟核（nucleoid）即染色体（bacterialchromosome）是一环形双链DNA分子。细菌细胞在生长过程中，其双链环形DNA分子在一个特定位置上起始复制，该位置称为复制原点，也称复制起点。复制原点是一约由300个碱基组成的特异序列，它能被特异的起始蛋白所识别；DNA复制从原点开始，向两个相反的方向延伸，最终形成两个子染色体DNA分子。在细胞分裂形成的两个子代细胞中，分别含有一个遗传信息完整的拟核。细菌染色体的复制二、微生物的群体生长规律对微生物群体生长的研究表明，微生物的群体生长规律因其种类不同而异，单细胞微生物与多细胞微生物的群体生长表现出不同的生长动力学特性。但就单细胞微生物来说，在特定的环境中，不同种的微生物表现出趋势相近的生长动力学规律。（一）、细菌纯培养生长曲线是将某种单细胞微生物少量接种到恒定容积的液体培养基中培养，定时取样分析。以菌数的对数(或光密度值)为纵坐标，生长时间为横坐标作图而的得到的生长曲线。细菌生长曲线的分期滞留适应期对数生长期稳定生长期衰亡期1.滞留适应期（Lagphase）当少量菌种接种到液体培养基中后，在开始的一段时间内细胞数目不增加，生长速度近于零，曲线平缓，称延缓期。此期菌体虽不分裂，但细胞代谢活力很强，菌体体积增长很快，对不良环境比较敏感，易被热、低温和高浓度盐溶液杀死。l该期的特点：（1）生长速率常数等于0。（2）细胞形态变大或增长。（3）细胞内的RNA尤其是rRNA含量增高，原生质呈嗜碱性。（4）合成代谢活跃，核糖体、酶类和ATP合成加快，易产生诱导酶。（5）对外界不良条件如NaCl溶液浓度、温度和抗生素等理化因素反应敏感。l产生原因：（1）接种后，一时还缺乏分解或催化有关底物的酶，或缺乏充足的中间代谢产物。（2）暂时缺乏足够的能量和必需的生长因子。（3）“种子”老化或未充分活化。l影响因素（1）菌种类型（2）种龄、即生理年龄（3）接种量（4）培养基成分：营养丰富度与接近度l缩短措施（1）通过遗传育种方法改变种的遗传特性使延缓期缩短（2）利用“对数生长期”的细胞作为种子。（3）尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大。（4）适当扩大接种量。2.对数期（Logphase）特点1）生长速率常数R最大。细胞每分裂一次所需时间——代时G（generationtime，）或原生质增加一倍所需的倍增时间最短2）细胞稳定（平衡）生长：细胞内各种物质按比例生长，菌体成分均匀；3）酶活性高，代谢稳定，菌体大小基本一致。l影响代时（G）的因素（1）菌种：不同的菌种G相差极大。（P155）（2）营养成分：同一种微生物，在营养丰富的培养基上生长，其代时较短，反之则长。（3）营养物浓度：影响生长速率和生长总量。（4）培养温度菌体经过一段时间的适应后，就以最快的速度进行分裂繁殖，菌数以几何级数增加，所以称对数期。此期的特点是代谢旺盛、细胞保持有规律的高速繁殖，个体形态和生理特性比较一致。l应用意义指数期的微生物因其具有整个群体的生理特性较为一致、细胞各成分平衡增长和生长速率恒定等优点，故是用作代谢、生理等研究的良好材料，是增殖噬菌体的最适宿主，也是发酵工业中用做种子的最佳材料。3.稳定期（Stationaryphase）特点：1）生长速度为零，新生=死亡，达到动态平衡；2）活菌数的总量达到最大值；3）胞内的储藏物开始形成（如肝糖粒、脂肪粒等）；4）某些芽孢菌的芽孢开始形成；5）某些细菌过量积累次级代谢产物，如抗生素、维生素等。l稳定期到来的原因：（1）营养物质尤其是生长限制因子的耗尽。（2）营养物的比例失调，如C/N比不合适。（3）酸、醇、毒素或H2O2等有害代谢产物的积累。（4）Ph、氧化还原势等物理化学条件越来越不适宜。l控制措施（1）补充营养物质（2）移走代谢产物（3）改善培养条件l意义：（1）是产物最佳的收获期，主要是对以菌体生产或与菌体生长相平行的代谢产物为目的的某些发酵生产。（2）对维生素、碱基、氨基酸等物质是最佳的生物测定时期。（3）通过对稳定期到来的原因的研究，还促进连续培养原理的提出和工艺、技术的创建。4.衰亡期（Deathphase）特点：1）生长速率负增长；2）细胞形态多样，出现畸形，形成衰退型；3）蛋白水解酶活跃，出现细胞自溶现象;4）芽孢细菌芽孢大量释放。l抵抗措施（1）部分细菌产生抗逆性，形成休眠体，降低死亡率。（2）迟效的C、N源产生二次生长。第二节微生物的培养与生长量测定一、微生物生长量的测定1.直接计数法（全数法）：2.间接计数法（活菌计数法）3.测定细胞物质量获得纯培养的技术稀释平板分离法平皿划线分离法单细胞挑取法利用选择性培养基分离法富集培养二元培养：是纯培养的一种特殊形式，主要用于分离寄生微生物的方法。共培养(Coculture)稀释分离法从混杂着大量细菌的样品中将某种细菌分离出来，最基本的方法是使各个细胞彼此分开，再进行挑选。所以必须将待测样品稀释，一般常用的方法如下：⑴稀释平皿分离法⑵平皿划线分离法⑶单细胞挑取法稀释倒平板法（pourplatemethod）操作步骤：1、样品的稀释过程2、取适量不同浓度梯度的稀释液，与已灭菌过熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合；摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中；平面来回摇匀，待琼脂凝固后，即制成可能含菌的琼脂平板。3、在一定条件下（温度、湿度、光照）培养一定时间即可出现菌落（在表面或内部）。4、挑取单个菌落，进一步做平板划线分离，便可得到纯培养物。该法使用对象：热不敏感微生物。其主要缺点是易造成热敏感微生物死亡；且一些严格好氧菌被固定在培养基中间缺氧气而影响生长或死亡。一、微生物纯培养技术纯培养(Pureculture)：微生物学中将在实验室条件下从一个细胞或一种细胞群繁殖得到的后代称为纯培养二、分批培养与连续培养（一）分批培养(batchculture):在一个相对独立密闭的系统中，一次性投入培养基对微生物进行接种培养的方式一般称为分批培养。由于培养系统的相对密闭性，故分批培养也叫密闭培养（closedculture）。如在微生物研究中用烧瓶作为培养容器进行的微生物培养一般是分批培养。采用分批培养方式时，随着培养时间的延长，由于系统相对密闭性，被微生物消耗的营养物得不到及时地补充，代谢产物未能及时排出培养系统，其它对微生物生长有抑制作用的环境条件得不到及时改善，使微生物细胞生长繁殖所需的营养条件与外部环境逐步恶化，从而使微生物群体生长表现出从细胞对新环境的适应到逐步进入快速生长，而后较快转入稳定期，最后走向衰亡的阶段分明的群体生长过程。（二）、连续培养连续培养方式恒浊器法(Turbidostat)：指不断调节流速而使细菌培养液保持恒定的连续培养方法；主要用于获得大量菌体或与菌体相平行的代谢产物。恒化器法(Chemostat)：指控制恒定的流速，使由于细菌生长而耗去的营养物质及时得到补充，培养基中营养物浓度基本恒定，从而保持细菌的恒定生长速率。连续培养法装置恒浊与恒化培养控制装置分批培养与连续培养的比较分批培养与连续培养的优缺点比较及其运用(p159)三、同步培养通过机械方法和调控培养条件使某一群体中的所有微生物个体细胞尽可能处于同一生长和分裂周期中，从而使细胞群体中各个体处于分裂步调一致的生长状态，这种生长状态称为同步生长(synchronousgrowth)。获得微生物同步生长的方法主要有以下两类：①机械筛选法。这一方法是利用处于同一生长阶段细胞的体积与大小的同一性，用过滤、密度梯度离心或膜洗脱等方法收集同步生长的细胞。②诱导法。这一方法是用理化条件（药物、营养物、温度、光照等）人为诱导控制微生物细胞群体处于某同一生长发育阶段，以获得同步生长细胞。四、微生物生长量的测定1.直接计数法（全数法）：2.间接计数法（活菌计数法）3.测定细胞物质量1.直接计数法（全数法）计数器计数法：•血球计数板•细菌计数板涂片染色计数法比浊法2.间接计数法（活菌计数法）平板菌落计数法液体稀释培养测数（MostProbableNumbermethod,MPN法）薄膜过滤计数法平板菌落计数法液体稀释培养测数（MostProbableNumbermethod,MPN法）稀释度10-310-410-510-610-710-8重复数555555出现生长555410的管数薄膜过滤计数法对于测定象空气、水等体积大而且含菌浓度较低的样品中的活菌数,应将待测样品通过微孔薄膜(如硝酸纤维素薄膜)过滤富集,再与膜一起放到合适培养基或浸有培养液的支持物表面上培养,最后可根据菌落数推算出样品含菌数。3.测定细胞物质量干重法含氮量测定法DNA测定法其他生理指标测定法：o物质的消耗o产生量o对氧的吸收o发酵糖产酸量o二氧化碳的释放量等1.测定细胞干重法将单位体积的液体培养基中培养的微生物,经过滤或离心收集菌体细胞,用水洗净附在细胞表面的残留培养基,105℃高温或真空下干燥至恒重,称重,即可求得培养物中的总生物量。2.DNA含量测定法DNA可与DABA一HCl(35.二氨基苯甲酸一盐酸)溶液反应显示特殊的荧光。根据这种荧光反应强度求得DNA含量。3.ATP含量测定法微生物细胞中都含有相对恒定量的ATP,而ATP与生物量之间有一定的比例关系。用适当的试剂从培养物中提取出ATP,以分光光度计测定它的荧光素一荧光素酶反应强度,经换算即可求得生物量。4.代谢活性法该法是通过测定生活细胞的代谢活性强度来估算其生物量。5.蛋白质量测定法蛋白质是细胞R的主要组分，而蛋白质的含量是比较稳定的。可以从蛋白质量的测定求出细胞物质量，或以测定芳香氨基酸量求蛋白质量。可以测定全氮量来求蛋白质量。蛋白质量=氮量×6.25；方法：菌体分离→洗涤→凯氏微量定氮法测定总氮含量。第三节：环境条件对微生物生长和代谢影响1温度1.1微生物生长的温度范围:根据微生物生长时对温度的要求不同，可将微生物分为三大类：⑴低温性微生物（又分专性和兼性，专性最适5－15℃，最高15－20℃；兼性最适10－20℃，最高30℃左右）⑵中温性微生物（最适20－40℃）⑶高温性微生物（最适45－60℃）l温度对微生物生长的影响（1）酶的活性（2）质膜的流动性（3）溶解度l最适生长温度及其意义某菌分裂代时最短或生长速率最高时的培养温度称之为最适生长温。