微生物的培养方法

微生物培养的目的各有不同，有些是以大量增殖微生物菌体为目标（如单细胞蛋白或胞内产物），有些则是希望在微生物生长的同时，实现目标代谢产物的大量积累。由于培养目标的不同，在培养方法上也就存在许多差别。微生物的培养方法从历史发展的角度来看，微生物培养技术的发展主要有以下特点：①从少量培养发展到大规模培养；②从浅盘培养发展到厚层固体或深层（液体）培养；③从以固体培养为主发展到以液体培养为主；④从静止式液体培养发展到通气搅拌式液体培养；⑤从分批培养发展到连续培养以至多级连续培养；⑥从游离的微生物细胞培养发展到利用固定化细胞培养；⑦从单一微生物培养发展到混合微生物培养；⑧从利用野生菌种发展到利用变异菌株以及“工程菌”。一、投料方式1、分批培养2、连续培养3、补料分批培养二、培养状态1、固体培养2、液体培养三、氧气1、厌氧2、好氧四、菌种的数量1、纯种培养2、混菌培养根据微生物种类、培养目的和要求、规模和资金投入的不同可以有不同形式的培养装置。一、投料方式1、分批培养细菌、酵母、霉菌的生长曲线一次性投料，一次性收获延滞期少量细菌接种到新鲜培养基后，一般不立即进行繁殖，生长速度近于零。因此在开始一段时间，细菌数几乎保持不变，甚至稍有减少。这段时间被称为延迟期，又称为迟缓期、调整期或滞留适应期。（1）延滞期出现原因（2）延滞的特点（3）影响延滞期限长短的因素（4）缩短延滞期的意义及方法A、微生物接种到一个新的环境，暂缺乏足够的能量和必需的生长因子；B、“种子”老化（即处于非对数生长期）或未充分活化。C、接种时造成的损伤（1）延滞期出现原因（2）延滞期的特点特点：1）生长速率常数为零；2）细胞形态变大或增长，许多杆菌可长成丝状。.细菌数量不增加或增加很少，代谢活跃；3）细胞内RNA，尤其是rRNA的含量很高，细胞的嗜碱性强；4）合成代谢十分活跃，核糖体、酶类和ATP的合成加速，易产生各种诱导酶5）对外界不良条件如NaCl溶液、温度和抗生素等理、理化因素反应敏感。（3）影响延滞期时间长短的因素B、接种龄:以对数期接种龄的种子接种，延滞期短C、接种量:发酵工业上通常采用种子：发酵培养基=1：10D、培养基成分:一般要求发酵培养基的成分或种子培养基的成分尽量接近，且应适当丰富些。A、菌种特性（4）缩短延滞期的意义及方法（1）意义：可以缩短生产周期，提高设备利用率（2）缩短延滞期的方法A、通过遗传学方法改变种的遗传特性使迟缓期缩短B、接种对数生长期的菌种，采用最适菌龄C、尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大D、加大接种量指数期对数期又称指数期。这一阶段突出特点是细菌数以几何级数增加，代时稳定，细菌数目的增加与原生质总量的增加，与菌液混浊度的增加均呈正相关性。特点1）生长速率常数R最大代时最短，生长速度最快；2）细胞稳定（平衡）生长：细胞内各种物质按比例生长，菌体成分均匀；3）酶系活跃，代谢旺盛。稳定期（1）出现原因A、营养的消耗C、引起pH值EH值的改变D、有害代谢产物积累B、营养物的比例失调（2）特点：1）生长常数为零，新生=死亡，达到动态平衡；2）活菌数的总量达到最大值；3）胞内的储藏物开始形成（如肝糖粒、脂肪粒等）；4）某些芽孢菌的芽孢开始形成；5）某些细菌过量积累次级代谢产物，如抗生素、维生素等。衰亡期特点：1）细菌代谢活性降低；2）细菌衰老并出现自溶；3）产生或释放出一些产物；如氨基酸、转化酶、外肽酶或抗生素等。4）菌体细胞呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊；有些革兰氏染色反应阳性菌此时会变成阴性反应2、连续培养是在微生物的整个培养期间，通过一定的方式使微生物能以恒定的比生长速率生长并能持续下去的一种培养方法。基本原则：在微生物培养过程中不断的补充营养物质和以同样的速率移出培养物。连续发酵的优点：1、高效2、产品质量较稳定3、节约了大量动力、人力、水和蒸汽，且使水、气、电的负荷均衡合理。缺点：1、菌种易退化2、易污染杂菌3、营养物的利用率一般低于单批增大。恒化器：与恒浊器相反，是一种设法使培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率条件下进行生长繁殖的一种连续培养装置。恒浊器：根据培养器内微生物的生长密度，并借光电控制系统来控制培养液流速，以取得菌体密度高，生长速度恒定的微生物细胞的连续培养器。恒浊器与恒化器的比较装置控制对象培养基培养基流速生长速率产物应用范围恒浊器菌体密度（内控制）无限制生长因子不恒定最高速率大量菌体或与菌体相平行的代谢产物生产为主恒化器培养基流速（外控制）有限制生长因子恒定低于最高速率不同生长速率的菌体实验室为主固定化细胞连续培养细胞固定化就是通过包埋法、微胶囊化、吸附法等手段，将微生物细胞限制在载体的内部或表面。固定化细胞培养与游离细胞培养相比，有以下一些优势：①固定化可提供较高的细胞密度；②固定化减少了细胞的流失，使细胞可以反复利用；③固定化可以提供对细胞有利的微环境；④可以保护某些细胞免受剪切损伤；⑤简化了下游的细胞分离步骤。固定化载体常常易碎，且固定的细胞容易脱落等原因的存在，固定化细胞培养器中的剪切力也不宜过高，一般采用填充柱、流动床或气升式反应器。机械搅拌式反应器只适用于载体牢固、不易脱落的固定化细胞。通常是将固定化细胞装在反应器内，一端流入培养基，另一端放出发酵液，而固定化微生物细胞始终停留在反应器内。3、补料分批发酵在生产实践中．完全封闭式的分批培养或纯粹的连续培养较为少见，更多见的是两者的折中形式——补料分批或流加发酵。补料发酵是根据菌株生长和初始培养基的特点，在分批培养的某些阶段适当补加部分配料成分或碳源，以提高菌体或代谢产物的产率。流加营养：水解糖（葡萄糖）、氨水补料分批发酵的特点有：1）可以减弱底物和代谢产物的抑制。微生物的生长会受到高浓度底物和逐步过量产生的代谢产物的抑制，若将初始底物浓度降低，就会限制菌体密度和产物浓度的提高。但采用间歇补料．通过不断的流加限制性底物就可克服该缺点。可以避免葡萄糖效应对微生物生长和产物积累的影响。流加补料还可稀释降低代谢产物的浓度，减轻其抑制生长作用。2）增加次级代谢产物的产量。次级代谢产物的合成常常在生长平衡期才开始合成，与稳定期的细胞密度和延续时间密切相关。但间歇发酵的平衡期比较短，因营养物质已大量消耗．可同化量很少．很快就进入衰亡期。通过补料可延长平衡期．增加次级代谢产物的产量。3）可以提高发酵的细胞密度。补料发酵时不断地向发酵罐补偿限制性底物，微生物始终能获得充分的营养，菌体密度就可以增加，合理改进发酵工艺．细胞密度可以达到10％以上干细胞，大大提高产率。4）可以恒定培养条件。发酵过程中的培养环境会随着代谢作用的进行而变化，如培养基的pH值，这时可流加氨水或通氨来恒定pH值．还补充氮源。二、培养状态1、固体培养2、液体培养1、固体培养固体培养就是利用固体培养基进行微生物的繁殖。固体培养在微生物鉴定、计数、纯化和保藏等方面发挥着重要作用。一些丝状真菌可以进行生产规模的固体发酵。实验室常见的固体培养试管斜面、培养皿平板、较大型的克氏扁瓶和茄子瓶斜面。用于菌种的分离、纯化、保藏和生产种子的制备。（1）用接种环挑取原始培养物后，在固体培养基表面划线接种（2）用涂布棒将少量的液体培养物涂布在整个固体培养基表面（3）将少量液体培养物与融化后降温至50～60度的固体培养基混匀，倒入培养皿中，浇注成平板。接种后的培养物直接放入培养箱中恒温培养。这些方法适用于好氧和兼性好氧微生物的培养。微好氧微生物采取穿刺培养对厌氧菌培养必需创造更严格的无氧环境厌氧培养皿。厌氧罐，Hungate滚管技术生产中常见的固体培养在生产实践中，好氧真菌的固体培养方法都是将接种后的固体基质薄薄地摊铺在容器的表面，可使菌体获得充足的氧气，又可以将生长过程中产生的热量及时释放。固体培养使用的基本培养基原料是小麦麸皮等。灭菌后待冷却到合适温度便可接种。固体培养基中的含水量控制在40％～80％之间（典型的液体培养基含水量在95％以上），细菌和酵母菌将无法忍受如此低水含量的环境，所以，固体培养被细菌或酵母菌污染的可能性大大降低。麸曲、食用菌、酱豆、米酒米曲霉固体培养生产日本酒曲2.液体培养液体培养就是将微生物接种到液体培养基中进行培养。由于大多数发酵微生物是好氧性的，而且微生物只能利用溶解氧，所以，如何保证在培养液中有较高的溶解氧浓度至关重要。一般可通过增加液体与氧的接触面积或提高氧分压来提高溶氧速率。实验室常见的液体培养在实验室进行好氧菌液体培养的方法主要有四种。（1）试管液体培养此法的通气效果一般较差，仅适用于培养兼性好氧菌，以及进行微生物的各种生理生化试验。（2）浅层液体培养在三角烧瓶中装入浅层培养液，其通气量与装液量、棉塞通气程度密切相关。通气量对微生物的生长速度和生长量有很大关系，该方法一般也仅适于兼性好氧菌。（3）摇瓶培养盖8～12层纱布或用疏松的棉塞塞住以阻止空气中杂菌或杂质进入瓶内，而空气可以透过纱布或棉塞供微生物呼吸之用。一般装液量为三角瓶的10％以下，如250ml三角瓶装10～20ml培养液。三角瓶内设置挡板或添加玻璃珠等。将摇瓶放在摇床上以一定速度保温振荡培养，摇床有旋转式和往复式两类。摇瓶培养在实验室里被广泛用于微生物的生理生化试验、发酵和菌种筛选等，也常在发酵工业中用于种子培养。（4）台式发酵罐实验室用的发酵罐体积一般为几升到几十升。自动控制和记录装置如配置有PH、溶解氧、温度和泡沫检测电极，有加热或冷却装置，有补料、消泡和PH调节用的酸或碱贮罐及其自动记录装置，大多由计算机控制。因为它的结构与生产用的大型发酵罐接近，所以，它是实验室模拟生产实践的主要试验工具生产中常见的液体培养液体培养生产效率高，适于机械化和自动化，所以它是当前微生物发酵工业的主要生产方式。液体培养有静置培养和通气培养两种类型：静置培养适于厌氧菌发酵，如酒精、丙酮一丁醇、乳酸等发酵；通气发酵适于好氧菌发酵，如抗生素、氨基酸、核苷酸等发酵。（1）浅盘培养：容器中盛装浅层液体静立培养，没有通气搅拌设备，全靠液体表面与空气接触进行氧气交换，这是最为原始的液体培养形式，劳动强度大，生产效率低，易污染。早期的青霉素和柠檬酸发酵曾采用过浅盘培养。当时生产一千克青霉素就需要100万个容积为一升的培养瓶。（2）发酵罐深层培养液体深层培养的主体设备是发酵罐。发酵罐可以为微生物提供丰富而均匀的营养，良好的通气搅拌，适宜的温度和酸碱度，并能防止杂菌污染。为此，发酵罐通常配备有培养基配制系统、蒸汽灭菌系统、空气压缩过滤系统和补料系统。其生产效率较高，易于控制，产品质量稳定，因而在发酵工业中被广泛应用。但是，深层培养耗费的动力较大，设备较为复杂，需要较大的投资。大型发酵罐的发酵一般需分几级进行，使发酵的种子逐级扩大，以提高发酵罐的利用率并节约能源等。罐的级数一般是根据菌体繁殖速度以及发酵罐的容积而确定的：如谷氨酸发酵多采用二级培养；而生长较慢的青霉素和链霉素生产菌种一般需要三级培养。大规模液体培养的厌氧菌：丙酮-丁醇发酵丙酮-丁醇梭菌的生长可以分为两个阶段：前期较短，以产菌体为主，生长温度以37℃为宜；后期较长，以产丙酮一丁醇为主，温度以33℃为宜。这样的生产流程可连续运转一年以上，并达到比单级连续发酵高得多的生产效率。三、其他培养方法1、双菌或者多菌培养现代发酵工业以纯种发酵为主，而传统的固态白酒和酱油的发酵都是多菌培养发酵的结果。在自然界微生物之间的共生与互生关系也是双菌与多菌共同生存的常例，这种关系反映了微生物存在着代谢”接力棒”的依赖状态，能相互改善生存条件。双菌发酵：维生素C的二步法▲采用欧文氏菌和棒状杆菌进行串联发酵，先将厂葡萄糖转化成2，5-二酮基葡萄糖酸．再进一步转化产牛2-酮某古龙酸。▲以山梨醇作为发酵的主要原料，利用生黑葡萄糖酸杆菌或弱氧醋酸杆菌先进行第一步发酵，所生成的山梨糖80℃加热几分钟后再加入灭菌的辅料（玉米浆，尿素及无机盐等），开始第二步的混合菌株发酵。当作为伴生菌