POD活性测定

可见光的范围350-770，紫外A400-315nm，B315-280nm，C280-190nm酶活单位=△ODmg一1·FW·min一11.POD活性测定：称取组织1g放于研钵中，加5mL0.05mol/L的磷酸缓冲液（pH5.5）在冰浴中研磨成匀浆。将匀浆全部转入离心管中，在3000rpm，4℃条件下离心10min，上清液为酶粗提液，4℃保存备用。取酶液100μL，加反应混合液1.2.9ml0.05mol/L的磷酸缓冲液(pH5.5)2.1mL0.05mol/L愈创木酚溶液，0.05mol/L愈创木酚溶液,0.06207g愈创木酚定容10ml3.1.0ml2%H2O2,30%H2O2670μL，加水至10ml.在37℃水浴中混合均匀，于470nm处测定其吸光度，连续记录3min。以不加酶的反应混合液作对照，每30秒钟读一次数，以每分钟吸光度值变化值0.01为一个酶活单位。酶活计算:OD290。g-1.FW.h-1=OD变化值/材料鲜重/反应时间POD的酶活性增加倍数与抗病性呈正相关2.CAT活性测定：设置两个重复一个对照,测定体系包括1.0.2ml酶液、2.1.5ml磷酸缓冲液pH7.0、3.1ml蒸馏水，4.25℃预热后逐管加入300μL0.1mol/L的H2O2(30%H2O256.8μL加水至10ml.)在240nm下测定吸光度，每隔1min读一次，共测3min，以1min内减少0.1的酶量为1个酶活单位。3.SOD活性的测定：采用改进的高灵敏度的氯化硝基氮兰四唑（NBT）光还原法测定SOD活性。每处理取3个小烧杯，分别加入3mLSOD反应液（参照附录B），A）0.lmol/LpH7.8磷酸缓冲液准确称取0.72gNa2HPO4·12H2O溶于20ml水中取18.3mL；准确称取0.312gNaH2PO4·2H2O溶于20mL水中取1.7mL，混合并定容至20mL。（B）104mmol/L的甲硫氨酸称取0.39g甲硫氨酸溶解并定容至25mL。（C）0.3mmol/L的NBT称取0.0025g氯化硝基氮兰四唑（NBT），溶解后定容于10mL。（D）0.8mmol/L的乙二胺四乙酸（EDTA）准确称取0.01gEDTA，定容于25mL。（E）50μmol/L的核黄素称取0.0012g核黄素，定容于10mL容量瓶中。取A液8mL、B液2mL、C液4mL、D液2mL，共16mL混匀为SOD反应液。再加入150μL的50μmol/L的核黄素和150μL粗酶液，在25℃，4000Lx光照20min后于黑暗中停止反应。另作一组不加酶液其它处理同前的作为空白对照，并以pH7.8磷酸缓冲液调零。在560nm下测定吸光度。计算公式：SOD的OD560值/g鲜重=（对照OD560-样品OD560）/0.5×60分别计算不同酶液量的各反应系统中抑制NBT光还原的相对百分比,作出二者相关曲线,找出抑制NBT50%光化学还原的酶液量(μl),定为一个酶活单位U,计算总酶活单位和酶的比活性。4.MDA含量测定：取④中粗酶液1.5mL，加入2.5mL0.5%的硫代巴比妥酸（TBA，取0.5gTBA溶解于100mL20%三氯乙酸），在沸水浴中保温30min后，立即冷却，10000rpm离心20min，取上清液分别在450nm、532nm和600nm下测吸光度值（A），计算公式：MDA（μmol/L）=6.45（A532-A600）-0.56A450。5.PPO活性的测定：植物组织1g，用预冷的PH7.8(0.05M)磷酸缓冲液1ml，研磨，再加1ml缓冲液，倾入5ml离心管，于4度，10000rpm下离心20min，收集上清。反应体系为3ml0.2M邻苯二酚（用pH7.8磷酸缓冲液配制），1ml酶液，以灭活的酶液为空白对照，30度下水浴10min，立即用20%三氯乙酸中止反应。离心5000rpm10min，于495nm处测定其吸光值。6.PAL活性的测定：pH8.8硼酸缓冲液(含15mmol/L巯基乙醇)和50mgPVP，1.1.6mL0.1mol/L-1硼酸缓冲液(pH8.8，内含10mmol•L-1苯丙氨酸)2.0.2mL酶液,37℃反应1h后,加入0.2mL6mol•L-1HCl终止反应,测290nm处的吸光值,以反应时间零作参比。A290变化0.01为一个酶活单位(U•h-1•g-1•m-1)。活性=（OD值/0.01t）乘稀释倍数.附录B—超氧化物歧化酶（SOD）反应液（A）0.lmol/LpH7.8磷酸缓冲液准确称取7.2gNa2HPO4·12H2O溶于200mL水中取183mL；准确称取3.12gNaH2PO4·2H2O溶于200mL水中取17mL，混合并定容至200mL。（B）104mmol/L的甲硫氨酸准确称取0.78g甲硫氨酸溶解并定容至50mL。（C）0.3mmol/L的NBT准确称取0.025g氯化硝基氮兰四唑（NBT），溶解后定容于100mL容量瓶中。（D）0.8mmol/L的乙二胺四乙酸（EDTA）准确称取0.02gEDTA，定容于50mL容量瓶中。（E）0.32mmol/L的核黄素准确称取0.012g核黄素，定容于100mL容量瓶中。取A液40mL、B液10mL、C液20mL、D液10mL，共80mL混匀为SOD反应液。过氧化物酶、多酚氧化酶、过氧化氢酶、苯丙氨酸解氨酶在五分钟内，所读取的5个数值，以每分钟数值最大的为所测得的酶活性，之所以测量5次，就是为了找出吸光值变化最大的，也就是酶活性最大的区间值PALPOD酶活结果都跟书上的不同，吸光值该增大的，没有增大，反而降低。伤口接种：用灭过菌的接种刀在叶中部垂直于叶脉处割一个约6mm的伤口，于伤口处贴菌丝处理5株，重复3次，对照在伤口处贴无菌的培养块。参照Viaud等[1]的离体叶片接种法:在培养皿内铺双层滤纸,加少量水,进行灭菌。剪取生长整齐一致的各供试寄主幼苗的第1片平展真叶,冲洗后用75%的酒精表面消毒30s,用灭菌水冲洗3遍,待吸干叶表水后,展平铺到灭菌培养皿上。用直径为3mm的打孔器在培养好的各地灰霉菌菌落边缘打取菌饼,反接于叶片的不同部位。每片叶接4块菌饼,每个菌株在每个寄主上接5片叶,对照接相同大小的PDA培养基块。接种后置于25℃恒温光照培养箱内,3d后调查发病情况。按照十字交叉法测量病斑大小,并根据各处理的病斑大小评价各菌株致病力的差异。参照朱建兰等[9]的灰霉病斑调查方法,其分级标准为:0级,无症状或症状不明显;1级,形成直径2~5mm(包含2mm)水渍状黄褐色病斑;2级,形成直径5~10mm(包含5mm)水渍状黄褐色病斑;3级,形成直径10~15mm(包含10mm)水渍状黄褐色病斑;4级,形成直径15~20mm(包含15mm)水渍状黄褐色病斑;5级,形成直径≥20mm水渍状黄褐色病斑。用DPS统计软件对供试灰霉菌株引起的病斑直径数据进行方差分析,采用Duncan’s新复极差检验(LSRtest)进行多重比较。根据灰霉菌株在不同寄主叶片上形成病斑的大小,将供试12个菌株的致病力类型分为强、中、弱3种,平均病斑大小在3级以上的菌株为强致病力,平均病斑在1级以下的菌株为弱致病力,平均病斑在2级的菌株为中等致病力。1.毒素对植株防御酶系活性的影响1.采用幼苗浸渍法，取5一6叶期的大蒜幼苗，洗净根部，放入盛有300mL粗毒素的烧杯中，置于20℃培养箱培养，同时设蒸馏水为对照，并分别在处理后的第12、24、36、48、60、72、84h分别取第3叶位叶片，每次取样9株，液氮速冻。待马铃薯植株生长到6叶时,进行叶面喷雾接种,以清水处理作为对照,接种后保湿36h。于接种后1、2、3、4、5和6d取样,用于酶活性测定,每处理测定重复3次,取平均值。采用DPS软件进行方差分析。2.菌对植株防御酶活性及丙二醛含量的影响10L酶液加0.02mol/L的邻苯二酚1.5mL和0.05mol/LpH6.8磷酸盐缓冲液，1.5mL蒸馏水，总体积为3mL，以不加酶液的为对照.30℃反应2min后在410nm波长下测定吸光值.酶活单位U定义为在410nm波长下吸光值变化0.01所需酶量.