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实验五免疫酶技术及其应用——ELISA一、实验目的A.了解和掌握免疫酶技术的测定原理。B.掌握酶联免疫吸附测定技术的操作步骤，学会利用竞争ELISA的方法，定量测定抗体或抗原。C.了解免疫酶技术在生物学和医学研究的重要意义及应用价值。二、实验原理•免疫标记技术（immunolabellingtechnique）:是指用荧光素、放射性同位素、酶、发光剂或电子致密物质等作为示踪剂，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。特点：高度灵敏、特异、快速，定性、定量、定位分类：免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技术、免疫电镜技术、免疫胶体金技术和发光免疫测定。•免疫酶技术(enzymeimmunoassay)：是将抗原和抗体的特异性免疫反应与酶的催化反应相结合而建立的一种免疫检测技术。就是利用酶标记抗体或抗原，以检测相应抗原或抗体的一种免疫学标记技术。•酶联免疫吸附试验ELISA（enzymelinkedimmunosorbentassay）是一类常用的免疫酶技术。是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相表面进行。常用的酶：辣根过氧化物酶(HRP)碱性磷酸酶（AP）。ELISA检测抗原Ag+Ab*↔Ag-Ab*ELISA检测抗体Ab+Ag*↔Ab-Ag*ELISA检测抗体Ag+Ab1↔Ag-Ab1Ag-Ab1+Ab2*↔Ag-Ab1-Ab2*竞争ELISA检测抗原固定OD值实验材料：•羊抗人血清白蛋白抗体（一抗）•已知含量的人血清白蛋白（作标准曲线）•待检人血清白蛋白•辣根过氧化物酶标记的驴抗羊抗体（二抗）•包被液CBS：PH9.6，0.05mol/L碳酸盐缓冲液•洗板液或稀释液：PH7.4，0.01mol/LPBS•底物溶液：OPD-H2O2•终止液：2mol/LH2S04•酶标反应板（一条/人）三、操作步骤1.包被抗原抗原用包被液（CBS）稀释至合适浓度，加入到酶标板中，100μl/孔，放入湿盒中，4℃过夜。次日，用洗板液洗板3次（将洗板液加入每孔，1min后倾去），以洗去未包被的游离抗原。抗原100ul/孔湿盒中，4℃过夜酶标板2.抗原与抗体的预孵育制作标准曲线：在稀释板中，用PBS倍比稀释标准抗原，每种浓度的抗原最终为50μl，分别在各抗原孔中加入250μl一定浓度的抗体，放入37℃恒温培养箱中30min。待测抗原：取50μl未知浓度的抗原按照同上操作。待测抗原50ulPBS50ul50ul稀释液50ul50ul100ul标准抗原250ul抗体稀释板37℃，30min3.与固相抗原的竞争结合取稀释板中预孵育的抗原抗体混合液100μl，加入酶标板的抗原孔中，放入37℃恒温培养箱中60min。洗板3次。100ul稀释板酶标板37℃，60min洗板3次4.酶标二抗的结合酶标抗体用稀释液稀释至工作浓度后，加入每孔中，100ul/孔，置湿盒中放37℃30min。洗板3次。5.加入底物显色液（用前再配制，并置棕色瓶内）每孔加入底物显色液，100ul/孔，湿盒中37℃保温一定时间。6.终止反应待出现明显颜色反应（或一定时间）后，加入终止液，50ul/孔以终止反应。7.结果测定用酶标仪在492nm波长下测定OD值。以标准抗原的浓度为横坐标，相应的OD值为纵坐标绘制标准曲线，计算未知抗原的浓度。四、思考题1.在定量测定抗原时，直接ELISA与竞争ELISA有何区别？从理论上分析一下各自的优缺点。2.在实际操作中，你认为有哪些因素可以影响定量检测的结果？（操作中应注意的问题）3.实验设计题：如何用竞争ELISA来定量检测抗体？