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染色质免疫沉淀技术（ChIP）实验方法实验原理染色质免疫沉淀技术（ChIP）通过与染色质片段共沉淀和PCR技术，在体内检测与特异蛋白质结合的DNA片段。ChIP技术最大的优点就是在活体细胞状态下研究了蛋白质和目的基因结合状况，减少了体外实验的误差。在活体细胞中，先对与调节蛋白结合的染色质进行分离，然后通过一定的方法（例如：超声波）随机剪切染色质，用调节蛋白的抗体沉淀目的染色质，再通过一定手段把目的染色质上的蛋白质去除掉，最后用PCR等方法检测鉴定共沉淀的DNA片段的特性。仪器和试剂真空设备、涡旋器、液氮、冷冻离心管、离心机、超声波粉碎仪、miracloth37%甲醛，2M甘氨酸，ddH2O，剪切的鲑精DNA/proteinA琼脂糖珠(Santcruz)，蛋白酶K（14mg/ml）,RNaseA,酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）,氯仿,无水乙醇,提取缓冲液1（EB1）:0.4M蔗糖；10mMTris-HCl，pH8.0；5mMβ-ME；0.1mMPMSF；蛋白酶抑制剂混合物（aprotinin、pepstainA、Leupeptin、Antipain、TPCK、Benzamidine）•提取缓冲液2（EB2）:0.25M蔗糖；10mMTris-HCl，pH8.0；10mMMgCl2；1%TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)；5mMβ-ME；0.1mMPMSF；蛋白酶抑制剂混合物（同上）提取缓冲液3（EB3）：1.7M蔗糖；10mMTris-HCl，pH8.0；0.15%TritonX-100；2mMMgCl2；5mMβ-ME；0.1mMPMSF；蛋白酶抑制剂混合物（同上）核裂解缓冲液（NLB）：50mMTris-HCl，pH8.0；10mMEDTA；1%SDS；PMSF和蛋白酶抑制剂混合物（同上）ChIP稀释缓冲液（ChIPDB）：1.1%TritonX-100；1.2mMEDTA；16.7mMTris-HCl，pH8.0；167mMNaCl；PMSF和蛋白酶抑制剂混合物（同上）洗脱缓冲液（EB）：1%SDS；0.1MNaHCO3（现配）低盐洗脱液：150mMNaCl；0.1%SDS；1%TritonX-100；2mMEDTA；20mMTris-HCl，pH8.0高盐洗脱液：500mMNaCl；0.1%SDS；1%TritonX-100；2mMEDTA；20mMTris-HCl，pH8.0LiCl洗脱液：0.25MLiCl；1%NP-40；1%脱氧胆酸钠；2mMEDTA；20mMTris-HCl，pH8.0TE缓冲液：1mMEDTA；10mMTris-HCl，pH8.0实验方法植物材料的准备（以拟南芥为例）1．在覆盖有保鲜膜的土里播上拟南芥的种子。2．约3周后，在50ml管中收集1.5g的幼苗，无菌水洗2次。甲醛固定4．室温下把幼苗浸在37ml含1%的甲醛的EB1液中，抽真空10min。5．加入2M甘氨酸使终浓度至0.125M，中止反应，继续抽真空5min，此时幼苗应该变为半透明。(加2M甘氨酸约2.5ml)6．用40ml水洗幼苗3-4遍。7．去除幼苗水分，将幼苗液氮冷冻-80℃保存或继续进行下面操作。分离和超声染色质（注：除特殊注明，所有操作都在4℃进行）8．液氮预冷研钵和杵子，液氮研磨幼苗成粉末状。9．在50ml管中加入30mlEB1悬浮组织。(此时，EB1中不含甲醛)10．4层miracloth过滤组织到一个新的50ml管中。11．4℃，2880g离心20min。12．小心去上清，1mlEB2重悬沉淀。13．转移至一个新的1.5ml离心管。14．4℃，12000g离心10min。15．300ulEB3重悬沉淀。16．转入另一已加入300ulEB3新管中。17．4℃，16000g离心1小时。18．去上清，300ulNLB重悬沉淀（4℃操作），涡旋，用枪头吹打，保留10ul溶液做后续检测。（在上胶前，该溶液按下面DNA解交联的操作步骤一样）19．超声波处理溶液，打断DNA成约0.5-2kb的DNA片段。打断的染色质可以-80℃保存，或进行后续操作。免疫沉淀20．4℃，16000g离心5min沉淀碎片。21．转移上清到一个新管。保留10ul溶液去检测超声效率（按第35步往后处理）做后续检测(以第18步保留的溶液做对照，电泳检测DNA片段的长度)。22．分200ul到2个新管，每管100ul。23．每管加900ulChIP稀释液，使SDS浓度变为0.1%SDS。24．每个样品加4—40ul剪切的鲑精DNA/蛋白A琼脂糖珠（用前，珠必须洗3次，然后重悬于ChIP稀释液中），4℃，轻轻晃动1小时。（注：鲑精DNA/蛋白A琼脂糖珠的用量需要根据购买的产品质量进行调整）25．4℃，16000g离心2min。26．合并2管上清（约2ml），分装2ml到3个EP管中（每管666ul）。27．加4ul抗体到其中的2管中，另一管作为阴性对照。28．4℃过夜，并轻轻晃动。29．再加4—40ul剪切的鲑精DNA/蛋白A琼脂糖珠（事先用ChIP稀释液洗涤处理），4℃轻微晃动1小时，收集免疫沉淀。30．准备新鲜的洗脱缓冲液（1%SDS，0.1MNaHCO3，现配）。31．4℃，16000g离心2min，取沉淀，每次1ml洗脱液洗沉淀10min。洗脱液顺序如下：（1）低盐洗脱液1次（2）高盐洗脱液1次（3）LiCl洗脱液1次（4）TE缓冲液2次最后，去除TE缓冲液。洗脱和染色质的解交联32．加250ul新鲜的洗脱缓冲液（第30步已准备）到沉淀珠中，以释放和珠结合复合物。33．混匀，65℃水浴15min，轻微晃动。34．小心取上清转移到新管，重复洗涤珠，合并2次洗液。35．加20ul5MNaCl，65℃孵育过夜，以解染色质的固定。36．加10ul0.5MEDTA，20ul1MTris-HCl，pH6.5，和1.5ul14mg/ml的蛋白酶K，65℃温育1小时。37．等体积酚/氯仿抽提DNA，在有novagenpelletpaint存在的情况下乙醇沉淀DNA，70%乙醇洗沉淀。38．用40-50ulTE缓冲液（含10ug/mlRNaseA）溶解DNA。纯化的DNA片段可用于PCR扩增检测目的基因，或者可用多重PCR来鉴定目的基因的有无（与内参对照）。39．在25ulPCR体系中，模板加0.5ul。模板的变化依赖于免疫沉淀的效果。附：剪切的鲑精DNA/蛋白A琼脂糖珠混合物（1MTris-HCl，pH6.5；5MNaCl；0.5MEDTA，65℃加热封闭）（玻璃珠规格：212-to300-umdiameter;sigma）制备方法：1．制备100ml灭菌TE（10mMTris，pH8.0；1mMEDTA，pH8.0）2．结合：50mgBSA（做稀释抗体用）；0.5ml叠氮化钠（从5%的储存液中吸取），补充TE到47.5ml，0.2u滤膜过滤（溶液II）。3．用15ml灭菌TE洗20ml蛋白A珠（50%slurry）2次。4．结合：10mlproteinA，4mg剪切的ssDNA，20ml灭菌的溶液II，4℃振摇45分钟。5．分装4℃保存注意事项：1．材料固定要充分，使其全部沉到底部。抽气后在冰上固定半小时，固定时间勿太长，否则可能会影响之后的抗体结合。2．16步中重悬物轻轻滴加在另一新管中的EB3上。3．19步中超声条件根据不同材料调整，如100W,超声10秒，间隔15秒，超声4次。4．24步中洗蛋白A琼脂糖珠时可将琼脂糖珠轻轻弹开，混合均匀，以便充分洗涤。5．31步中洗脱过程中也要轻轻弹开琼脂糖珠。参考文献：ChrisBowler,GiovannaBenvenuto,PierreLaflamme,DianaMolino,AlineV.Probst,MuhammadTariqandJerzyPaszkowski，Chromatintechniquesforplantcells，ThePlantJournal(2004)39,776–789染色质免疫沉淀（ChIP）技术的难点及应用柴晶晶博士序言随着人类基因组测序工作的基本完成，功能基因组学的研究逐渐成为研究的热点。而基因表达的调控又是功能基因组学的一个重要研究领域。研究某个蛋白因子的调控功能，可以通过对蛋白活性（激活或抑制其活性），蛋白数量（过表达Overexpression或基因缺陷型Knockout）,以及蛋白功能（功能缺陷型蛋白Dominant-negativemutation）的控制，影响下游基因的表达，而下游基因的变化又可以通过基因芯片（cDNAMicroarray），抑制消减杂交（SuppressionSubtractiveHybridization），差异显示RT-PCR等方法进行研究[1]。然而这些方法都无法提供证据证明这些变化是受某个蛋白因子直接调节的，还是间接的其他变化导致的结果。所以，要想提供蛋白因子直接调控的证据，就要直接检测蛋白质-DNA的相互作用。传统的方法包括转录因子结合实验（TranscriptionFactorAssay），电泳迁移率变动分析（electrophoreticmobilityshiftassay），DNaseI足印法（DNaseIfootprinting），酵母单杂交系统等。但这些方法都有一定的局限性，不能充分反映生理情况下DNA与蛋白相互作用的真实情况，而且很难捕捉到在染色质水平上基因表达调控的动态瞬时事件[2]。染色质免疫沉淀技术（ChromatinImmunoprecipitation，简称ChIP）是研究体内蛋白质与DNA相互作用的一种技术。它利用抗原抗体反应的特异性，可以真实地反映体内蛋白因子与基因组DNA结合的状况。特别是近年来由于该技术不断的发展和完善，其应用范围已经从研究目的蛋白与已知靶序列间的相互作用，发展到研究目的蛋白与整个基因组的未知序列的相互作用；从研究一个目的蛋白与DNA的相互作用，发展到研究两个蛋白与DNA共同结合的相互作用；从研究启动子区域的组蛋白的修饰，发展到研究结合在DNA序列上的蛋白复合物。随着对基因功能研究的不断深入，这项技术正越来越多的被应用于科研的各个领域。目前已经有成熟的ChIP试剂盒出售，如Millipore公司提供的EZ-ChIP试剂盒，使得越来越多的研究者更容易地采用染色质沉淀技术在许多研究领域取得了成功。ChIP技术的原理染色质免疫沉淀技术的原理是：在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起，通过超声或酶处理将染色质切为小片段后，利用抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来。染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定，染色质断裂，染色质免疫沉淀，交联反应的逆转，DNA的纯化，以及DNA的鉴定。因为ChIP实验涉及的步骤多，结果的重复性较低，所以对ChIP实验过程的每一步都应设计相应的对照，而且对结果的分析也需要有一定的经验。对于刚刚开始使用ChIP技术的研究人员来说，使用成熟的商品化试剂盒和相关的技术服务会达到事半功倍的效果，比如Millipore公司的EZ-ChIP试剂盒就是专门为初学者设计的入门产品。下面我们就最基本的实验步骤，实验中的小技巧以及需要注意的问题简单介绍一下。1.细胞固定甲醛能有效的使蛋白质-蛋白质，蛋白质-DNA，蛋白质-RNA交联，形成生物复合体，防止细胞内组分的重新分布。甲醛的交联反应是完全可逆的，便于在后续步骤中对DNA和蛋白质进行分析。交联所用的甲醛终浓度为1%，交联时间通常为5分钟到1个小时，具体时间根据实验而定。值得注意的是，交联时间如果过长，细胞染色质难以用超声波破碎，影响ChIP结果，而且实验材料也容易在离心过程中丢失。交联时间如果过短，则交联不完全，产生假阴性。甲醛的交联反应可被加入的甘氨酸终止。2.染色质断裂交联后的染色质可被超声波或MicrococcalNuclease切成400~600bp的片段（用琼脂糖凝胶电泳检测），以便暴露目标蛋白，利于抗体识别。超声波是使用机械力断裂染色质，容易引起升温或产生泡沫，这都会引起蛋白质变性，