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土壤与环境微生物研究法／李振高，骆永明，滕应编著．一北京：科学出版社，2008过氧化氢酶（398-399）脲酶（404-405）磷酸酶（412-413）关松荫/土壤酶及其研究法农业出版社1986年七月第一版蔗糖酶274-276土壤脲酶（urease）活性的测定方法：靛酚比色法（一）方法原理土壤中脲酶活性的测定是以尿素为基质，酶促水解生成的氨与酚类化合物起反应生成蓝色的靛酚，颜色深度与氨含量相关，因而用于脲酶活性的测定。（二）试剂1）甲苯2）10%尿素：称取10g尿素，加蒸馏水90ml。3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：取184g柠檬酸溶于300ml蒸馏水中，另取147.5gKOH溶于蒸馏水，再将二种溶液合并，用1NNaOH将pH调节至6.7，用水稀释至1L。4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5克苯酚溶于少量乙醇，加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮，用乙醇稀释至100毫升（A液），存于冰箱中；27克NaOH溶于100毫升水（B液）,存于冰箱中。将A、B溶液保存在冰箱中。使用前将两种溶液各20ml混合，用蒸馏水稀释至100ml。5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。6）氮的标准溶液：精确称取0.4717克硫酸铵溶于水并稀释至1000mL，得到1mL含有0.1mg氮的标准液（100ppm）。（三）测定步骤（1）标准曲线绘制吸取配置好的氮溶液10mL，定容至100mL，即为10ppm，吸取0、1、2、3、4、5、10、15、20mL移至50mL容量瓶，加水至20mL，再加入4mL苯酚钠，仔细混合，加入3mL次氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟,用水稀释至刻度。即为0、0.2ppm、0.4ppm、0.6ppm、0.8ppm、1ppm、2ppm、3ppm、4ppm的标准曲线。将着色液在紫外分光光度计上于578nm处进行比色测定，以标准溶液浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制曲线图。（2）土壤中脲酶活性的测定称取10g土壤置于100ml容量瓶中。用2mL甲苯处理15分钟。往瓶中加入10mL10%尿素溶液和20mL柠檬酸缓冲液（pH6.7）。仔细混合后，将瓶放在37℃恒温箱中，放置24h。之后用38℃水定容至100ml（甲苯浮在刻度线上）。与此同时，进行以水代替基质（10ml10%尿素用10ml蒸馏水代替），及无土对照测定。培养结束后，将悬液过滤。吸取3mL（视情况而定）滤液于50mL容量瓶中，用蒸馏水加至10mL。然后按标准曲线绘制的操作加入苯酚钠等试剂，显色，比色，最后根据标准曲线求出氨态氮含量。以每克土壤在37℃下24h内酶解尿素释放的NH3-N的毫克数来表示脲酶活性。二.过氧化氢酶测定(容量法)1.试剂配制a.0.3％过氧化氢溶液：将10ml30%的过氧化氢用水稀释至1L，此溶液不稳定，需临时配置。b.1.5mol/L硫酸：8.4ml浓硫酸溶于水，再用蒸馏水稀释至100mlc.0.002NKMnO4溶液：称取化学纯高锰酸钾0.3161g，溶于1升蒸馏水中，贮于棕色瓶中，备用。如果知道酶活性很高的话可以适当变化高锰酸钾浓度2.操作步骤（1）取5g过1mm风干土，置于150mL三角瓶中，并注入40mL蒸馏水和5mL0.3％H2O2溶液。（2）同时设置对照，即三角瓶中注入40mL蒸馏水和5mL0.3％过氧化氢溶液，而不加土样。并作无土对照。（3）将三角瓶放在振荡机上振荡（120r/min）30min后，加入5mL1.5mol/L硫酸，以稳定未分解的过氧化氢。再将瓶中悬液用慢速滤纸过滤。吸取25mL滤液，用0.002N高锰酸钾滴定至淡粉红色终点（30s不退色）。3.结果计算以单位土重消耗的0.002moi/l高锰酸钾毫升数（对照与试验测定的差）表示土壤过氧化氢酶活性，其计算式为土壤过氧化氢酶活性（mlKMnO4/g干土）=V/dwt式中，V为0.002mol/L高锰酸钾毫升数（ml）；dwt为烘干土壤重量（g）。用于滴定土壤滤液所消耗的高锰酸钾量（毫升数）为B，用于滴定25mL原始的过氧化氢混合液所消耗的高锰酸钾量（毫升数）为A。（A-B）×T即为过氧化氢酶活性高锰酸钾溶液标定吸取2ml0.1N草酸钠标准液于200ml三角瓶中，并加水至80ml左右，投入几粒玻璃珠，再加5ml1:3的硫酸酸化，在电炉上加热2min，取下稍冷，趁热（70-80度）用高锰酸钾溶液滴定，滴至为红色（30s不退色）即达到终点，记下高锰酸钾的毫升数（V）。高锰酸钾溶液标准浓度按下式计算c（1/5KMnO4）=m/（V1-V2）*0.06700式中c（1/5KMnO4）=—高锰酸钾标准液之物质的量浓度，mol/L；m——草酸钠之质量，g；V1——高锰酸钾溶液之用量，mL；V2——空白试验用高锰酸钾溶液之用量，mL；0.06700——与1.00mL高锰酸钾溶液c（1/5KMnO4）=1.000mol/l相当的以克表示的草酸钠的质量。土壤磷酸酶测定方法：磷酸苯二钠法磷酸酶(phosphatase)能酶促有机磷化合物的水解。试验表明，土壤微生物对于土壤含磷有机物的矿化起着主要的作用；某些高等植物的根系也有磷酸酶活性。土壤的磷酸酶活性可以表征土壤的肥力状况（特别是磷的状况）。（一）基本原理土壤磷酸酶活性的测定常用各种磷酸酯作为基质。应用得最多的是酚酞磷酸酯、苯磷酸酯、甘油磷酸酯、α或β-萘磷酸酯和Р-硝基苯磷酸酯等的水溶性钠盐。当它们被酶促水解时，能析出无机磷和基质的有机基团。因此磷酸酶活性的测定是测定基质水解后的无机磷或酚的部分。这里介绍的方法是测定基质水解时生成的酚量。该法可用于测定各种磷酸酶的活性：碱性磷酸酶（用pH10的硼酸盐缓冲液），中性磷酸酶（用pH7.0的柠檬酸盐缓冲液），酸性磷酸酶（用pH5.0的乙酸盐缓冲液）。（二）实验试剂1．酶促反应试剂1)甲苯。2)苯磷酸二钠溶液：将6.75g苯磷酸二钠溶液(C6H5P04Na2·2H20)溶于水，并稀释至1000mL（1mL含25mg酚）。3)乙酸盐缓冲液(pH5.0)：称取136g乙酸钠(C2H302Na)溶于700mL去离子水，用乙酸调节至pH5.0，用去离子水稀释至l000mL。4)柠檬酸盐缓冲液(pH7.0)：称取300g柠檬酸钾(C6H507K3)溶于700mL去离子水，用稀盐酸调节至pH7.0，用去离子水稀释至1000mL。5)硼酸盐缓冲液（pH9.6与pH10.0）：称取12.404g硼酸(H3B03)溶于700ml)去离子水，用稀NaOH溶液调节至pH10.0，用去离子水稀释至1000ml。2．测定试剂1)Gibbs试剂：将200mg2，6-双溴苯醌氯酰亚胺(C6H2BrCINO)溶于乙醇，并稀释至100mL。2)标准溶液：(a)母液：lg酚溶于蒸馏水中，并稀释至1000ml_，溶液保存在暗色瓶中；(b)工作液：10mL溶液(a)稀释至1000mL(lmL含10μg酚)。（三）操作步骤1)取10g过1mm筛的风干土样置于l00mL容量瓶中，用1.5mL甲苯处理（泥炭土用5rnl_甲苯）。2)处理15rnin后，注入l0mL苯磷酸二钠溶液和l0mL相应的缓冲液（根据磷酸酶的性质确定）。3)将反应混合物置于37℃恒温箱中，培养3h后(若不显色或显色不明显，则时间可增至24h)，用38℃的热水将瓶中内容物稀释至刻度（甲苯应浮在刻度以上），再用致密滤纸过滤。4)对每一土样，设置用10mL水代替苯磷酸二钠基质的对照。并作空白无土对照5)比色程序：a取滤液1ml置于100ml_容量瓶中，加5mL相应的缓冲液（根据酶的性质确定），用水稀释至25mL，加1mLGibbs试剂。b将反应物仔细混合，静置20min。这时溶液呈现青色。c用水将瓶中混合物稀释至刻度，并在24h内，用lcm液槽，在分光光度计上于波长578nm处测定颜色的深度，读取消光值。d以供试样品所得消光值减去对照样品消光值的差，根据标准曲线，求出酚量。当酚含量小于50mg时，用2～4cm液槽进行比色。土壤磷酸酶活性，以每百克土的酚毫克数表示，其计算式为土壤磷酸酶活性[μg苯酚/(g干土·h)]一(C×V)/dwt式中，c为土壤滤液中苯酚含量(rug／mL)；V为土壤溶液体积(mL)；dwt为烘干土壤重量(g)。土壤蔗糖酶测定方法转化酶（蔗糖酶）存在于所有土壤中，它能酶促蔗糖分子中果糖残基内的β-葡萄糖苷碳原子处的键裂解，使蔗糖水解成还原己糖（葡萄糖和果糖），其反应式如下：C12H22O11+H2OC6H12O6+C6H12O6土壤的转化酶活性，与土壤中的腐殖质、水溶性有机质和黏粒的含量以及微生物的数量及其活动呈正相关。随着土壤熟化程度的提高，转化酶的活性亦增强。人们常用土壤的转化酶活性来表征土壤的熟化程度和肥力水平。蔗糖酶与土壤许多因子有相关性，如与土壤有机质、氮、磷含量，微生物数量及土壤呼吸强度有关，一般情况下，土壤肥力越高，蔗糖酶活性越高。蔗糖酶酶解所生成的还原糖与3,5-二硝基水杨酸反应而生成橙色的3-氨基-5-硝基水杨酸。颜色深度与还原糖量相关，因而可用测定还原糖量来表示蔗糖酶的活性。二、试剂1）酶促反应试剂：基质8%蔗糖，pH5.5磷酸缓冲液：1/15M磷酸氢二钠（11.876gNa2HPO4·2H2O溶于1L蒸馏水中）0.5ml加1/15M磷酸二氢钾（9.078gKH2PO4溶于1L蒸馏水中）9.5ml即成，甲苯2）葡萄糖标准液（5mg/mL）预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。准确称取500mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至100mL容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4℃保存期约一星期）。若该溶液发生混浊和出现絮状物现象，则应弃之，重新配制。3）3,5-二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）称0.5g二硝基水杨酸，溶于20ml2mol/LNaOH和50ml水中，再加30g酒石酸钾钠，用水稀释定容至100ml（保存期不过7天）。三、操作步骤（1）标准曲线绘制吸5mg/mL的标准葡糖糖溶液10ml于100ml容量中，定容。从中吸取0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.5、2、3ml于50ml容量瓶，加DNS试剂3mL混匀，于沸水浴中准确反应5min（从试管放入重新沸腾时算起），取出立即泠水浴中冷却至室温，定容。即为浓度为0ppm、2ppm、4ppm、8ppm、12ppm、15ppm、20ppm、30ppm的标准曲线。以空白管调零在波长508nm处比色，以OD值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。（2）土壤蔗糖酶测定称取10.00g土壤，置于100mL容量瓶中，注入30ml8%蔗糖溶液，10mlpH5.5磷酸缓冲液和1ml甲苯。摇匀混合物后，放入恒温箱，在37℃下培养24h。到时取出，迅速过滤。从中吸取滤液2~10ml（适量，无蔗糖对照吸取20ml），注入50ml容量瓶中，加3mlDNS试剂，并在沸腾的水浴锅中加热5min，随即将容量瓶移至自来水流下冷却3min。溶液因生成3-氨基-5-硝基水杨酸而呈橙黄色，最后用蒸馏水稀释至50ml，并在分光光度计上于508nm处进行比色。（为了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的误差，每一土样需做无基质对照，整个试验需做无土壤对照；如果样品吸光值超过标曲的最大值，则应该增加分取倍数或减少培养的土样。）蔗糖酶