杀菌剂的作用机制

杀菌剂的作用机制一、影响细胞结构和功能1、影响真菌细胞壁的形成真菌细胞壁作为真菌和周围环境的分界面，起着保护和定型的作用。细胞壁干重的80%由碳水化合物组成，几丁质是由数百个N-乙酰葡萄糖胺分子β-1,4-葡萄糖苷键连接而成的多聚糖。几丁质的合成由3个几丁质合成酶(Ghs)来调节，Ghs1的作用是修复细胞分裂造成的芽痕及初生隔膜的损伤，Ghs2用于初生隔膜中几丁质的合成，Ghs3合成孢子壁中的脱乙酰几丁质及芽痕和两侧细胞壁中90%的几丁质。在三者的作用下，将N-乙酰葡萄糖胺合成为几丁质。不同的多糖链相互缠绕组成粗壮的链，这些链构成的网络系统嵌入在蛋白质及类脂和一些小分子多糖的基质中，这一结构使真菌细胞壁具有良好的机械硬度和强度。细胞壁受影响后的中毒现象通常表现为芽管末端膨大或扭曲，分枝增多等异型，造成这一类异型的原因是细胞壁上纤维原的结构变形。有实践意义的杀菌剂对的作用主要是影响细胞壁的形成。通过抑制真菌细胞壁中多糖的合成，或者与多糖及糖蛋白相结合的机制破坏细胞壁结构，达到抑制或杀灭真菌的目的。杀菌剂对菌体细胞的破坏作用之一是抑制几丁质的生物合成，抑制的药剂有稻瘟净、异稻瘟净、灰黄霉素、甲基托布津、克瘟散、多氧霉素D、青霉素等。如异稻瘟净是通过抑制乙酰氨基葡萄糖的聚合而抑制几丁质的合成，影响稻瘟病菌细胞壁的形成。多抗霉素和华光霉素是作用于真菌细胞壁的抗生素，使细胞壁变薄或失去完整性，造成细胞膜暴露，最后由于渗透压差导致原生质渗漏，两者结构上属于核苷肽类，是几丁质合成底物UDP-N-G1cNAa的结构类似物，因而是几丁质合成酶的竞争性抑制剂。多氧霉素D的抑制几丁质合成酶；青霉素则是阻碍了细胞壁上胞壁质（黏肽）的氨基酸结合，使细胞壁的结构受到破坏，表现为原生质体裸露，继而瓦解。2、影响真菌质膜生物合成菌体细胞膜的主要化学成分为脂类、蛋白质、糖类、水、无机盐和金属离子等。杀菌剂对菌体细胞膜的破坏以及对膜功能的抑制有两种情况，即物理性破坏和化学性抑制。物理性破坏是指膜的亚单位连接点的疏水链被杀菌剂击断，导致膜上出现裂缝，或者是杀菌剂分子中的饱和烃侧链溶解膜上的脂质部分，使之出现空隙，于是杀菌剂分子就可以从不饱和脂肪酸之间挤出去，使其分裂开来。膜结构中的金属桥，由于金属和一些杀菌剂，如N-甲基二硫代氨基甲酸钠螯合而遭破坏，另外，膜上金属桥的正常结构也可被膜亲和力大的离子改变。化学性抑制是指与膜性能有关的酶的活性及膜脂中的固醇类和甾醇的生物合成受到抑制。（1）细胞膜性能有关的酶抑制剂与膜性能有关的酶的活性被抑制，可用两类化合物予以说明。一类是有机磷类化合物，另一类是含铜、汞等重金属的化合物。有机磷类化合物除了前面述及的抑制细胞壁组分几丁质的合成外，还能抑制细胞膜上糖脂的形成。含铜、汞等重金属的化合物中的金属离子可以与许多成分反应，甚至直接沉淀蛋白质。（2）甾醇合成抑制剂甾醇合成抑制剂实际上也属于细胞膜组分合成抑制剂。菌体细胞的膜脂类中有一种重要作用，就是甾醇。如果甾醇合成受阻，膜的结构和功能就要受到损害，最后导致菌体细胞死亡。与杀菌剂有关的主要是麦角甾醇。麦角甾醇是植物细胞膜的重要组分，其合成受阻将间接地影响细胞膜的通透性功能。此外，麦角甾醇还是甾类激素的前体，在无性、有性生殖过程中起重要作用。麦角甾醇生物合成的步骤很多，其合成抑制剂的种类和数量也很多。但大部分是抑制C14上的脱甲基化反应，故也称之为脱甲基化反应抑制剂，其抑制过程被认为是一种叫做多功能氧化酶的催化下进行的。该酶系中辅助因子细胞色素P-450起着重要作用。P-450中重要结构单元铁卟啉环，可以结合氧原子形成铁氧络合物，脱甲基化是氧化脱甲基化过程，该过程甲霜卟啉铁氧络合物将活泼的氧转移到底物上，如羊毛甾醇的C14的甲基上。目前至少有8类、几十个杀菌剂品种的作用机制是抑制麦角甾醇合成。从化学结构上来看，这类杀菌剂包含嘧啶类、吡啶类、哌嗪类、咪唑类、三唑类、吗啉类和哌啶类等化合物。抑制麦角甾醇的生物合成的杀菌剂有哌嗪类的嗪氨灵，吡啶类的敌灭啶、嘧啶类的嘧菌醇、氯苯嘧菌醇、氟苯嘧菌醇，唑类的灭菌特、抑霉唑、乙环唑、三环唑、三唑酮、三唑醇、双苯三唑醇、氟唑醇、烯唑醇、烯效唑、多效唑等。上述杀菌剂中以三唑类杀菌剂最多，研究表明，主要是分子中三环唑上经sp2杂化的氮原子具有孤对电子，克与铁卟啉的中心铁原子配位而阻碍铁卟啉铁氧络合物的形成，因而抑制了羊毛甾醇的C14脱甲基化反应最终导致麦角甾醇不能合成。（二）有效细胞能量生成菌体所需的能量来自体内的糖类、脂肪、蛋白质等营养物质的氧化分解，最终生成二氧化碳和水，其中伴随着脱氢过程和电子传递的一系列氧化还原反应，故此过程也称为细胞生物氧化或生物呼吸。根据与能量生成有关的酶被抑制的部位或能量生成被抑制的不同过程，可分为巯基（-SH）抑制剂、糖的酵解和脂肪酸β-氧化抑制剂、三羧酸循环抑制剂、电子传递和氧化磷酸化抑制剂等。1、巯基（-SH）抑制剂生物体内进行的各种氧化作用，均受到各种酶的催化，其中起着重要作用的许多脱氢酶系中都含有巯基。因此，能与巯基发生作用的药剂必然会抑制菌体的生物氧化（呼吸）。巯基在菌体呼吸中有普遍性的作用，而几乎所有的经典杀菌剂，即保护性杀菌剂，都对巯基有抑制作用。巯基是许多脱氢酶活性部位不可缺少的活性基团。现已知道，一些重金属化合物、有机锡制剂、有机砷制剂、有些有机铜制剂、二硫代氨基甲酸类杀菌剂、醌类化合物等均是巯基抑制剂。取代苯类杀菌剂以百菌清为代表，还有diclroan和dichlone,其主要机制在于和含-SH的酶反应，抑制了含-SH基团酶的活性，特别是磷酸甘油醛脱氢酶的活性。2、糖酵解和脂肪酸β-氧化抑制剂（1）糖酵解受阻糖是菌体重要的能量和碳源。糖分解产生能量，以满足菌体生命活动的需要，糖代谢的中间产物又可变成其他含碳化合物如氨基酸、脂肪酸、核苷等。糖酵解是糖分解代谢的共同途径，也是三羧酸循环和氧化磷酸化的前奏。糖酵解生成的丙酮酸进入菌体的线粒体，经三羧酸循环彻底氧化生成二氧化碳和水。杀菌剂如克菌丹等作用于糖酵解过程中的丙酮酸脱氢酶中的辅酶—焦磷酸硫胺素，阻碍了糖酵解的最后一个阶段的反应。另外，催化糖酵解过程的一些酶，如磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶等，要由K+,Mg2+等离子来活化。而有些铜、汞杀菌剂，能破坏菌体细胞膜，使一些金属离子特别是K+向细胞外渗漏，结果使酶得不到活化而阻碍糖酵解的进行。（2）脂肪酸氧化受阻脂肪酸氧化受阻主要是脂肪酸β-氧化受阻。所谓β-氧化是不需要氧的氧化，其特点是从羧基的β-位碳原子开始，每次分解出二碳片断。这个过程是在菌体的线粒体中进行的。脂肪酸的β-氧化需要一种叫辅酶A(以CoA-SH表示)的酶来催化。杀菌剂如克菌丹、二氯萘醌、代森类与CoA-SH中的-SH发生作用，使酶失活，从而抑制了脂肪酸的β-氧化。（3）三羧酸循环抑制剂乙酰辅酶A（以CH3-SCoA表示）中的乙酰基在生物体内受一系列酶的催化，经一系列脱羧，最终生成CO₂和H₂O，并产生能量的过程叫三羧酸循环，简写作TCA。在真核细胞中TCA循环是在线粒体中进行的，催化每一步反应的酶也都位于线粒体内。由于乙酰氟吗A可来源于糖、脂肪或氨基酸的代谢分解，所以TCA循环也是糖、脂肪及氨基酸氧化代谢的最终通路。因此，它是生物氧化的重要过程。杀菌剂对TCA循环的抑制，有4个过程被证实：①乙酰辅酶A和草酰乙酸缩合成柠檬酸的过程受到阻碍该反应受阻的原因是辅酶A的活性受到抑制。其机制是辅酶A中的巯基与杀菌剂发生反应，从而使该酶的活性被抑制。抑制的药剂有：二硫代氨基甲酸类，如福美锌、福美双、代森锌；醌类，如二氯萘醌；酚类；三氯甲基和三氯甲硫基类，如克菌丹、灭菌丹等。②柠檬酸异构化生成异柠檬酸过程受阻该过程是由于(顺）-乌头酸酶受到杀菌剂的抑制而使上述反应受到阻碍。(顺)-乌头酸酶是含铁的非铁卟啉蛋白，所以与Fe2+生成络合物的药剂（如8-羟基喹啉）都能对其起抑制作用。③α-酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酸的过程受阻上述反应过程受阻的原因是α-酮戊二酸脱氢酶复合体的活性受到杀菌剂的抑制。这种抑制机制要涉及与硫胺磷酸（TPP）和硫辛酰胺等辅酶组分的反应，抑制药剂有克菌丹、砷化物、叶枯散等。④琥珀酸脱氢生成延胡索酸及苹果酸脱氢生成草酰乙酸过程受阻琥珀酸脱氢酶是三羧酸循环中唯一掺入线粒体内膜的酶，它直接与呼吸链相联系。琥珀酸脱氢生成的还原型黄素腺嘌呤二核苷酸（FADH₂）可以转移到酶的铁-硫中心，继而进入呼吸链。抑制的药剂有：羧酰苯胺类，以氧硫杂环二烯为主，还有噻吩、噻唑、呋喃、吡唑、苯基等衍生物，代表品种有莠锈灵、氧化莠锈灵、邻酰胺、氟酰胺、硫磺、5-氧吩嗪、*****和异氰酸丁酯（后者为杀菌剂苯菌灵的降解产物之一）。（4）氧化磷酸化抑制剂菌体内的生物氧化进入三羧酸循环后，并没有完结，而是要继续进行最后的氧化磷酸化，即将生物氧化过程中释放出的自由能转移而使二磷酸腺苷（ADP）形成高能的三磷酸腺苷（ATP）。氧化磷酸化为菌体生存提供所需的能量ATP，所以这一过程一旦受到抑制，就会对菌体的生命活动带来严重后果。氧化磷酸化被抑制的情况有两种，一是其电子传递系统受阻，二是解欧联作用。①电子传递系统受阻还原型辅酶通过电子传递再氧化，这一过程由若干电子载体组成的电子传递链（也称呼吸链）完成。能够阻断呼吸链中某一部位电子传递的物质称为电子传阻断递抑制剂。这类药剂按其阻断的部位可分为以下几类：（Ⅰ）鱼藤酮、敌克松、十三吗啉、杀粉蝶菌素、安密妥等，它们阻断NADH至CoQ(辅酶Q)的电子传递.（Ⅱ）抗菌素A、硫磺、十三吗啉，它们阻断细胞色素b和细胞色素c之间的电子传递。（Ⅲ）氰化物、叠氮化物、硫化氢、一氧化碳等，它们阻断细胞色素和氧之间的电子传递。（Ⅳ）莠锈灵、8-羟基喹啉等，它们阻断琥珀酸脱氢酶至CoQ之间的电子传递。甲氧基内烯酸酯类杀菌剂来源于具有杀菌活性的天然抗生素，strobilurinA是一类作用机制独特、极具发展潜力和市场活力的新型农用杀菌剂，现已经商品化很多品种，均为能量生成抑制剂，其作用机理是键合在细胞色素b，从而抑制线粒体的呼吸作用。细胞色素b是细胞色素bc复合物的一部分，位于真菌和其他真核体的线粒体内膜，一旦某个抑制剂与之键合，它将阻止细胞色素b和c之间的电子传递，阻止ATP的产生而干扰真菌内的能量循环，从而杀灭病原菌。②解偶联作用解偶联的含义是使氧（电子传递）和磷酸化脱节，或者说使电子传递和ATP形成这两个过程分离，中断它们之间的密切联系，结果电子传递所产生的自由能都变为热能而得不到贮存。氟啶胺是一种强有力的解偶联剂，破坏氧化磷酸化，推测是分子中的氨基基团的质子化和质子化作用引起的。此外，五氯硝基苯也是解偶联剂。（三）影响细胞代谢物质合成及其功能主要包括对核酸、蛋白质、酶的合成和功能以及细胞有丝分裂的影响。1、影响真菌核酸合成和功能核酸在菌体中有很重要的作用，一旦核酸的生物合成受到抑制，菌的生命将会受到严重影响。核酸是重要的生物大分子化合物，其基本结构单位是核苷酸，核苷酸由核苷和磷酸组成。核苷由戊糖和碱基组成，碱基分为嘌呤碱和嘧啶碱两大类。药剂对核酸生物合成的影响，按核酸合成的过程分，主要有两个方面：其一是抑制核苷酸的前体组分结合到核苷酸中去；其二是抑制单核苷酸聚合为核酸的过程。如果按照抑制剂作用的性质不同来分，则又可分3类：第①类，是碱基嘌呤和嘧啶类似物，它们可以作为核苷酸地下拮抗物而抑制核酸前体的合成；第②类，是通过与DNA结合而改变其模板功能；第③类，是与核酸聚合酶结合而影响其活力。（1）嘌呤和嘧啶类似物有些人工合成的碱基类似物（杀菌剂或其他化合物）能抑制和干扰核酸的合成。例如6-巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、6-氮脲嘧啶、5-氟脲嘧啶、8-氮脲嘌呤等。这些碱基类似物在菌体细胞至少有两方面的作用。它们或者作为代谢拮抗物直接抑制核苷酸生物合成有关的酶类；或者通过掺入到核酸分子中去，形成所谓的“掺假的核酸”，形成异常的DNA或RNA，从而影响核酸的功能而导致突变。这类杀菌剂多为碱基类似物，它们都要变成其核苷酸形式后才能发挥作用，可能是通过负反馈抑制了