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华北煤炭医学院实验中心高级医学实验技术和实验室安全防护见习指导@100biotech.com目录实验(见习)课的一般要求---------------------------------3见习一实验室常用科研仪器的使用------------------------4见习二激光扫描共聚焦显微镜及免疫组织化学染色技术------9见习三细胞培养技术与流式细胞术------------------------13见习四透射电镜技术------------------------------------16主要参考书---------------------------------------------19实验（见习）课的一般要求一、上课须知@100biotech.com1．准备工作(1)上课前应阅读本实验中相应部分，明确实验的内容和要求。(2)根据实验内容阅读教材中的有关章节，弄清基本概念和方法，使实验能顺利完成。2．要求(1)遵守课堂纪律，注意聆听指导教师的讲解。(2)实验中的具体操作应按实验讲义的规定进行，如遇问题要及时向指导教师提出。(3)实验中出现的仪器故障必须及时向指导教师报告，不可随意自行处理。(4)进入实验室要穿白大衣。二、见习课所占课程成绩的比例及考核办法1．每次实验（见习）都要有实验（见习）报告，并有指导教师的评分和评语。实验（见习）成绩及批改情况要详细记录，存档备查。2．实验成绩占考核总成绩的20%。见习一实验室常用科研仪器的使用一、见习目的1．掌握离心机、双蒸水器、高压灭菌锅等常用仪器设备的使用。2．熟悉消毒、灭菌与无菌操作、免疫印迹等基本技术的原理。二、仪器设备@100biotech.com（一）常规仪器天平，振荡器，加样器，枪头等，离心机，制冰机，冰箱，纯水系统，磁力搅拌器，磁子，恒温水浴，（二）细胞培养系统超净台，二氧化碳培养箱，二氧化碳钢瓶，倒置显微镜系统，电动加样器，各种吸管（三）分子生物学有关仪器PCR仪，实时定量PCR仪，细菌培养，离心机，WesternBlot系统，杂交仪，酶标仪（四）大型仪器流式细胞仪，激光扫描共聚焦显微镜附：常用仪器使用说明以及部分实验步骤说明。三、见习方法（一）统一讲述实验中心科研仪器，按照实验用品顺序讲述（二）带领学生参观见习内容一离心机的使用一、原理：在离心力场的作用下，加速悬浮液中固体颗粒沉降（或漂浮）速度。二、操作方法1．接通离心机电源，打开机器开关，等待机器自检完毕。2．按open键（机器电子锁开），打开机器盖。3．根据使用需要选择合适的转子，将转子轻轻地套在旋转轴上，用六角螺丝刀旋转转子上的螺母，将转子固定。4．根据转子选择适合的离心管，将样品装入一对离心管后，在托盘天平上调节使它们质量相等，然后对称的放入转子中，先将转子的盖子旋紧，然后盖上机器盖。5．根据需要依次设置离心所需要的温度、运行程序（可不选择）、转速、离心时间（当触及某一项的按键时，显示屏上相对应的值会闪烁，设完一个参数可直接触及下一个按键，继续设定所需数值），设置结束后按“start/stop”开始运行机器。6．离心结束后，转子会逐渐地停下来，“open”键指示灯亮起，按此键打开离心室，旋开转子盖，取出样品。7．将离心管处理干净，倒置在小张滤纸上使其干燥，以便下次使用。旋上转子盖，关上机盖。若离心室内壁有冰霜待其化净干燥后，再旋上转子盖，关上机盖。@100biotech.com见习内容二消毒、灭菌与无菌操作技术一、仪器设备手提式高压灭菌锅、立式高压灭菌锅、全自动高压灭菌锅、烘箱、超净工作台、无菌室、酒精灯、滤菌过滤器二、仪器结构灭菌器：安全阀、压力表、放气阀、软管、紧固螺栓、灭菌桶、筛架、水（各种型号的结构有些不同，但是原理是一样的）。超净工作台：开关、风力调节器、灯开关。烘箱：电源开关、设温旋钮。三、原理1．干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。2．湿热灭菌是物品放入密闭的加压灭菌锅内加热，产生蒸汽，排除冷空气后密闭，使蒸汽不溢出，增大压强，使水的沸点升高，高于100℃，导致菌体蛋白质凝固变性达到目的。3．过滤除菌主要是选用孔径小的微孔材料制作成专门的细菌滤器，通过减压过滤，达到除菌。4．紫外线灭菌是指在波长200nm-300nm之间，紫外线诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成和DNA链的交联，从而抑制了DNA的复制达到灭菌。另外，由于辐射使空气中的氧电离成氧离子，氧离子再把氧气氧化成臭氧或使水被氧化为双氧水，臭氧和双氧水都有杀菌的作用。四、适用范围适用于任何无菌操作的实验。如：细胞传代培养、植物组织培养、细菌接种、微生物的分离纯化等各种高压蒸汽灭菌、干热灭菌、紫外线灭菌的原理和操作技术；无菌室、超净工作台的使用和在酒精灯火焰旁接种技术。五、操作步骤各种高压蒸汽灭菌、干热灭菌、紫外线灭菌的原理和操作技术；无菌室、超净工作台的使用和在酒精灯火焰旁接种技术。六、注意事项高压蒸汽灭菌开始前要把冷空气排尽，灭菌后要待压力降到“0”时才打开排气阀；烘箱灭菌要注意被灭菌物的灭菌温度；紫外线灭菌不要让紫外线照射人的皮肤；无菌室要定期用甲醛蒸汽熏蒸。@100biotech.com见习内容三蛋白质免疫印迹（WesternBlot）一、实验原理蛋白质印迹(Westernblotting)是将蛋白质转移并固定在化学合成膜的支撑物上，然后以特定的亲和反应、免疫反应或结合反应及显色系统分析此印迹。蛋白质印迹(免疫印迹)的实验包括5个步骤：1．固定(immobilization)：蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)并从胶上转移到硝酸纤维素膜上。2．封闭(blocked)：保持膜上没有特殊抗体结合的场所，使场所处于饱和状态，用以保护特异性抗体结合到膜上,并与蛋白质反应。3．初级抗体(第一抗体)是特异性的。4．第二抗体或配体试剂对于初级抗体是特异性结合并作为指示物。5．适当保温后的酶标记蛋白质区带，产生可见的、不溶解状态的颜色反应。二、试剂与器材1．试剂1)人IgG免疫兔的抗血清；2)辣根过氧化酶一羊抗兔IgG；3)PBS缓冲液：NaCl8g，KCl0.2g，KH2P04O．24g，Na2HP04•12H202.9g，加蒸馏水至1000ml，pH值为7.4；4)PBS-T缓冲液：PBS缓冲液加O.059／6Tween-20；5)封闭液：0.5％(质量分数)BSA(用PBS缓冲液配制)；6)底物溶液：A液：溶解30mgCN在5ml甲醇中；B液：溶解10mgDAB在5ml甲醇中；C液：分别搅拌A液和B液10～15rain，直到完全溶解，然后将A液和B液混合，加PBS至50ml，分成10ml一份，不用的可冷冻(一20~C)(下次直接化冻运用)；D液：取10mlC液，运用时加10ml30％(体积分数)H202；7)转移缓冲液：0.025mol／LTris，O．192mol／L甘氨酸(glycine)，20％(体积分数)甲醇(methan01)，pH值为8.3。2．器材1)半干转移槽；2)电泳仪电源：直流稳压，500V，150mA。@100biotech.com四、操作方法：1．SDS-PAGE将待检测的抗原粗提取液、纯化过程中的样品或纯化后的样品以及标准相对分子质量蛋白质等用SDS-PAGE分离。2．转移蛋白质到硝酸纤维素薄膜上1)准备转移缓冲液。2)切割与胶尺寸相符的硝酸纤维素薄膜，并用转移缓冲液浸湿，放置15min直到没有气泡。3)切割8张普通滤纸，其大小与胶尺寸大小相符，并将其浸泡在有转移缓冲液的培养皿中(与硝酸纤维素薄膜分开浸泡)。4)电泳后，切取有用部分的胶，并很快地在转移缓冲液中洗涤。5)打开蛋白质转移槽的盖板，依次放入：①4张用转移缓冲液浸泡过的滤纸；②用转移缓冲液洗过的胶，并小心地赶走滤纸和胶之间的所有气泡；③放上硝酸纤维素膜；④另4张用转移缓冲液浸泡过的滤纸；6)小心地合上转移槽的盖板；7)插入电极，注意正负极方向(硝酸纤维素膜面向阳极)，打开电泳仪开关，调至胶的面积(cm2)×O．8mA，1．5～2h。8)转移结束后打开盖板取出硝酸纤维素薄膜。3．免疫印迹膜的处理1)用PBS缓冲液洗膜5～10rain。2)将膜用封闭溶液封闭，用摇床轻摇(37℃)60min。3)用PBS缓冲液洗膜3次，每次10min。4)将膜置于第一抗体溶液(小牛血清免疫兔的抗血清，1：10)中，置摇床上轻摇，37℃摇动2h或4℃过夜。5)去掉第一抗体溶液，并用PBS洗膜3次，每次10min。6)将膜置于辣根过氧化酶一羊抗兔IgG溶液(1：500)中，37℃轻摇2h。7)去掉辣根过氧化酶一羊抗兔IgG溶液，并用PBS-T洗膜3次，每次10min。8)最后用PBS溶液洗，以转移Tween-20。9)加底物溶液反应2～10min，至抗原区带显色清楚为止。@100biotech.com10)用去离子水洗涤，以终止反应。将膜夹在滤纸间，干燥。置暗处保存。另外，加底物溶液的显色反应，亦可用增强化学发光法(enhancedchemiluminescenceECI)代替，以增加其灵敏度，即将膜经ECLkits处理后，用放射自显影法在X-光片上留下清晰的图像。见习二激光扫描共聚焦显微镜及免疫组织化学染色技术一、见习目的1．掌握免疫组织化学染色技术原理2．掌握激光扫描共聚焦显微镜硬件组成及其使用注意事项3．了解激光扫描共聚焦显微镜常用的基本操作：开、关机步骤二、器材和材料、样品1．器材激光扫描共聚焦显微镜、光学显微镜、离体心脏灌流系统等2．材料与样品骨关节炎、肿瘤（肠癌、子宫癌、肺癌、胃癌）等免疫组织化学染色标本三、实习内容和方法见习内容一激光扫描工聚焦显微镜技术一、激光扫描共聚焦显微镜的结构激光扫描共聚焦显微镜主要由以下几部分组成：电源及其稳压系统、激光器、扫描器（包括检测器）、荧光显微镜（装有微量步进马达）、光学装置、计算机控制系统。二、激光扫描共聚焦显微镜的使用注意事项@100biotech.com1．仪器环境周围要远离电磁辐射源。2．环境无振动，无强烈的空气流动。激光扫描共聚焦显微镜属于大型精密仪器，环境振动将引起仪器光路系统偏离，直接影响图象效果；测定样品过程中，振动及空气流动会使样品发生漂移，影响实验结果。3．室内应具有遮光系统，以防光线直接照射荧光样品而引起荧光改变。4．环境无尘。灰尘将影响仪器各部分的工作，尤其是影响光路系统和成像质量。5．仪器的工作温度5℃～45℃。无论仪器是否工作，最好使其环境始终保持在22℃±1℃的恒温，以防由于环境温度变化引起光路的偏移。6．注意保护仪器的光纤，防止挤压。三、激光扫描共聚焦显微镜的硬件操作步骤（一）开机步骤1．开机前要检查仪器的各开关，使之均处于关闭（OFF）的状态，然后接通总稳压器电源开关。2．接通主供电器电源开关，打开计算机，登陆WindowsXP系统。3．接通透射光电源（卤素灯）开关，调节灯电流使之适于观察样品。4．激光器：根据所用荧光染料发出的特征波长的荧光，打开相应的激光器（打开钥匙开关），并且打开风扇电源开关。1）多线氩离子(458nm,488nm,514nm)ON2）氦氖绿(543nm)ON3）氦氖红(633nm)ON5.打开汞灯电源开关。注意：当开启汞灯后，必须使其工作至少一小时后再关闭，并且要等其冷却15～20min后方可再次启动。为延长汞灯的使用寿命，尽量减少其开和关的次数。对易于发生荧光淬灭或光敏的样品，应尽量避免汞灯长时间照射，最好直接用卤素灯在低强度透射光下寻找到视野，然后转为激光扫描直接获取共焦图像。6.登陆FV10-ASW应用软件，进入操作系统