第十三章DNA芯片技术

第十三章DNA芯片技术第一节概述一、DNA芯片技术的概念基因芯片(Genechip)技术是指通过微阵列(Microarray)技术将高密度DNA片段阵列通过高速机器人或原位合成方式以一定的顺序或排列方式使其附着在如玻璃片等固相表面，以荧光标记的DNA探针，借助碱基互补杂交原理，进行大量的基因表达及监测等方面研究的最新革命性技术。DNAChipTechnologySolidsupport(glass,plastic,metal,silicon)MiniaturizedarrayofDNA(geneticmaterial)WorkonthebiochemicalprincipleofDNA/DNAhybridizationHybridizedprobes(DNAmolecules)arefluorescentlylabeled通常用计算机硅芯片作为固相支持物，所以称为DNA芯片。DNA芯片为生物芯片的一种：生物芯片包括：DNA芯片蛋白质芯片其它芯片按用途分–样品制备芯片–生化反应芯片–检测芯片芯片实验室是生物芯片技术发展的最终目标基因芯片发展历史Southern&NorthernBlotDotBlotMacroarrayMicroarray二、DNA芯片的主要类型按制备方式分：原位合成芯片：采用显微光蚀刻等技术在特定部位原位合成寡核苷酸而制备的芯片。探针较短DNA微集阵列：将预先制备的DNA片段以显微打印的方式有序地固化于支持物表面而制成的芯片。探针的来源较灵活ComparisonofDNAChipTechnologiesSensitivityofDNAchipbasedassaysisafunctionof:–ProbeandtargetDNA/RNA(Complexity)–Chipsurface(autofluorescence&non-spec.bkg)–Attachmentchemistry/methodology(hyb.efficiency&crosshyb.)–Hybridizationefficiency(lotsoffactors)–Detectiontechnology(signaltype,efficiency,noise)Oligo-ChipcDNA-ChipGenomicChip8nor20n2,000n50,000nsequencingexpressionexpressiongenomicanalysis第二节DNA芯片技术的基本原理与方法一、芯片的制备（一）支持物的预处理实性材料：硅芯片、玻片和瓷片需进行预处理，使其表面衍生出羟基、氨基活性基团。膜性材料：聚丙烯膜、尼龙膜、硝酸纤维膜通常包被氨基硅烷或多聚赖氨酸（二）原位合成芯片的制备1.显微光蚀刻技术支持物表面活性基团连接有光敏保护基团（X）受到保护。产率较低原位合成(InSituSynthesis)Lightdirectedoligonucleotidesynthesis.Asolidsupportisderivatizedwithacovalentlinkermoleculeterminatedwithaphotolabileprotectinggroup.Lightisdirectedthroughamasktodeprotectandactivateselectedsites,andprotectednucleotidescoupletotheactivatedsites.Theprocessisrepeated,activatingdifferentsetsofsitesandcouplingdifferentbasesallowingarbitraryDNAprobestobeconstructedateachsite.2.压电打印法压电毛细管喷射器产率较高喷墨打印技术RemovableTipOrificeHigh-SpeedMicroSolenoidValveSyringePumpSwitchingValveReservoirConnectingTubingController（三）DNA微集阵列的制备方式：预先合成DNA或制备基因探针然后打印到芯片上1.探针的制备已克隆的基因片段PCR，RT-PCR扩增的基因片段人工合成的DNA片段单链、双链、DNA或RNA均可作为探针2.打印喷墨打印（非接触式点样）优点、缺点针式打印（接触式点样）优点、缺点针式打印法（接触式点样）Best!3.探针的固化打印探针后，需要将其固定在支持物表面，同时也要封闭支持物上未打印区域以防止核酸样品的非特异性固定二、样品的准备样品的分离纯化DNA,mRNA扩增PCR,RT—PCR，固相PCR标记等过程荧光标记（常用Cy3、Cy5），生物素、放射性标记三、分子杂交样品与DNA芯片上的探针阵列进行杂交。与经典分子杂交的区别：1.杂交时间短，30分钟内完成2.可同时平行检测许多基因序列影响杂交反应的因素：盐浓度、温度、反应时间、DNA二级结构肽核酸(peptidenucleicacid,PNA)——是一类以氨基酸替代糖-磷酸主链的DNA类似物，骨架由重复的N-甘氨酸通过酰胺键相连构成，碱基则通过甲叉碳酰基与骨架相连。1.PNA分子内不会形成二级、三级结构2.DNA与PNA杂交不需要盐离子四、检测分析1.激光激发使含荧光标记的DNA片段发射荧光2.激光扫描仪或激光共聚焦显微镜采集各杂交点的信号3.软件进行进行图象分析和数据处理ResearchUse——FromSequencetofunction计算Ratio值(=Cy3/Cy5)。在0.5-2.0之外的定义为在两样本中有明显差异表达。进而获取初步功能信息。Clustering。第三节DNA芯片技术的应用DNA测序；杂交测序（SBH）基因表达分析：基因组研究：作图、测序、基因鉴定、基因功能分析基因诊断：寻找和检测与疾病相关的基因及在RNA水平上检测致病基因的表达药物研究与开发：cDNAmicroarrayexpressionpatternsofsmall(S)andlarge(L)neurons应用之一——基因表达谱（geneexpressionpattern)BiologicalSampleFunctionalInformation红色上调黄色不变绿色下调基因表达谱芯片的应用最为广泛，技术上也最成熟。这种芯片可以检测整个基因组范围的众多基因在mRNA表达水平的变化。它能对来源于不同个体、不同组织、不同细胞周期、不同发育阶段、不同分化阶段、不同生理病理、不同刺激条件下的组织细胞内基因表达情况进行对比分析。从而对基因群在个体特异性、组织特异性、发育特异性、分化特异性、疾病特异性、刺激特异性的变化特征和规律进行描述，进一步阐明基因的相互协同、抑制、互为因果等关系。有助于理解基因及其编码的蛋白质的生物学功能，并从已知生物学功能的基因推论未报道基因的生物学意义。同时，还可在基因水平上解释疾病的发病机理，为疾病诊断、药效跟踪、用药选择等提供有效手段。急性白血病、黑色素瘤、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌等表达谱芯片的研究。基因芯片的优点：1.高通量2.大规模3.高度平行性4.快速高效5.高灵敏度6.高度自动化