实验六TPPA检测梅毒螺旋体抗体和TRUST检测反应素

实验六TPPA检测梅毒螺旋体抗体和TRUST检测反应素医学检验系临床微生物免疫检验教研室何应中一、目的及要求掌握：凝集法的基本原理和TPPA检测梅毒螺旋体抗体的实验原理。熟悉：TRUST检测反应素的原理，TPPA的操作方法和结果判定。了解：TRUST的操作及结果判断，TPPA和TRUST的注意事项及临床意义。二、基本概念1.直接凝集反应：细菌、螺旋体、红细胞等颗粒抗原，在适当电解质参与下可直接与相应抗体结合出现肉眼可见的凝集现象。2.间接凝集反应：先将可溶性抗原(或抗体)吸附于适当大小的颗粒性载体表面，然后与相应抗体(或抗原)反应，在适当电解质参与下，出现特异性凝集现象。基本概念凝集反应是一种定性检测方法，根据凝集现象出现与否判定结果是否阳性或阴性，但也可做半定量检测，即将待测样本作一系列倍比稀释后进行反应，以出现凝集反应的最高稀释度为效价。基本概念梅毒螺旋体(treponemapallidum,TP)引起全身性慢性传染病--梅毒，主要通过性交传染。TP进入人体后，可产生两种抗体，一种是非特异性抗心拟脂抗体(又称反应素)，可用牛心拟脂检测，称非梅毒螺旋体抗原血清反应；另一种是抗梅毒螺旋体抗体，可用梅毒螺旋体检测出来，称梅毒螺旋体抗原血清反应。本次实验以梅毒螺旋体被动颗粒凝集试验(treponemapallidumpassiveparticleagglutinationtest，TPPA)检测梅毒螺旋体抗体和梅毒甲苯胺红不加热血清试验(syphilistoluidinereduntreatedserumtest，TRUST)检测血清中的反应素。三、梅毒螺旋体被动颗粒凝集试验(treponemapallidumpassiveparticleagglutinationtest，TPPA)检测梅毒螺旋体抗体（一）实验原理TPPA是将梅毒TreponemaPallidum(Nicho1s株)的精制菌体成分包被在人工载体明胶粒子上。这种致敏粒子和样品中的梅毒螺旋体(TP)抗体进行反应发生凝集，产生粒子凝集反应(ParticleAgglutinationTest；PA法)，由此可以检测出血清或血浆中的梅毒螺旋体(TP)抗体，并且可用来测定抗体效价。（二）试剂和器材1.梅毒螺旋体抗体诊断试剂(凝集法)包括溶解液、血清稀释液、致敏明胶粒子(冻干粉)、未致敏粒子(冻干粉)、阳性对照血清等，有商品供应。2.待测血清临床筛选获得。3.器材U型微量反应板、可调移液器(10～100μl,100～1000μl)、加样吸嘴、刻度滴管、25μl微量滴管、平板混合器、判定用观察板等。（三）操作方法1．1％致敏粒子和1％未致敏粒子的配制：分别加入一定量的溶解液溶解混匀即可。请在使用前30分钟于室温(15～30℃)下进行配制。2．用移液器加入血清稀释液100μl于U型微量反应板第1孔中，从第2孔至第6孔各加入25μl。操作方法3．用移液器取样本25μl至第1孔中混匀，然后用移液器从第1孔吸取25μl于第2孔中混匀，再从第2孔中吸取25μl于第3孔中……依次类推，以2N的方式从第1孔稀释至第6孔。4．用试剂盒中提供的滴管或移液器在第3孔中滴入1滴(25μl)未致敏粒子，从第4孔至第6孔各加入1滴(25μl)致敏粒子。操作方法5．用平板混合器(或用手轻轻撞击敲动)以不会导致微量反应板孔内容物溅出的强度混合30秒钟，加盖后于室温(15～30℃)下水平静置2小时后或次日，在观察镜上记录并观察其反应图像，或者利用免疫稀释判定装置进行测定。见表3。操作方法表3凝集法操作步骤WellNo.123456血清稀释液(ul)1002525252525待测血清(ul)25252525252525未致敏粒子(ul)25致敏粒子(ul)252525最终稀释倍数1:401:801:1601:320混匀，加盖后置室温(15～30℃)水平静置2小时或过夜，观察反应判定结果（四）结果判断1.反应图像判定在判定用观测板上静置微量反应板，观察粒子的反应图像。将反应图像与介质对照图像进行比较，并参照表4进行判断。表4凝集法反应图像判定反应图像判定粒子成纽扣状聚集,呈现外周边缘均匀且平滑的圆形(－)粒子形成小环状,呈现出外周边缘均匀且平滑的圆形(±)粒子环明显变大,外周边缘不均匀且杂乱凝集在周围(＋)产生均一的凝集,凝集粒子在底部整体上呈膜状延展(++)结果判断阳性：未致敏粒子最终稀释倍数1:40的反应图像判定为(－)，致敏粒子最终稀释倍数1:80以上的反应图像判定为(＋)，即最终判定为阳性，并将显示反应图像为(＋)的最高稀释倍数作为抗体效价。阴性：无论未致敏粒子呈现何种反应图像，只要致敏粒子最终稀释倍数1:80的反应图像显示为(－)时，最终判定为阴性。结果判断2．结果判定标准可疑：未致敏粒子最终稀释倍数1:40的反应图像判定为(－)且致敏粒子最终稀释倍数l:80的反应图像判定为(±)时，最终判定为可疑。注意！！！通过本试剂判定为抗体阳性或可疑的，经过一段时间再进行复查，并与其他检查结果和临床症状结合起来加以综合判断。结果判断（五）注意事项1.致敏粒子及未致敏粒子在使用前均应充分混匀。2.试验在滴加致敏粒子后反应板中液体须充分混匀后才能静置。3.反应静置过程中，反应板一定要加盖并禁止振摇。4.用本试剂判定结果为可疑时，请使用其他检查方法(FTA-ABS法等)。5.本试剂用来测定样品中的梅毒(TP)抗体效价，而不是直接用来测定TP。在判定为抗体阳性的情况下，请结合其他检查结果及临床症状进行综合判断。6.应注意血清凝集法免疫反应中可能发生的前带现象。注意事项7.TP感染初期，有可能不产生抗体，或产生抗体但数量很少的情况。如果已被怀疑为感染时，即使本试剂的判定结果为阴性，也要经过一段时间再进行检查并与其他检查(使用梅毒脂质抗原进行检查，FTA-ABS试验等)结果和临床症状结合起来加以综合判断。注意事项8．服用含有免疫球蛋白血液制剂的患者样品，有可能因服用制剂而呈阳性反应，应注意做出准确判定。9．待测样品可能存在HBV，HCV，HIV等，因此对待测样品及使用过的器具应按二级实验室生物安全处理(用次氯酸钠浸泡和＞121℃高压蒸汽灭菌l小时以上)。注意事项10.本试剂的溶解液、血清稀释液和阳性对照血清含有叠氮钠防腐剂。故在废弃时要用大量水冲洗，以避免生成具有爆炸性的金属叠氮。11.若发生试剂误溅入口中或眼里，应立即用大量清水冲洗，必要时到医院就诊。注意事项四、梅毒甲苯胺红不加热血清试验(TRUST)检测反应素（一）实验原理用牛心拟脂抗原吸附于特制甲苯胺红上制成致敏粒子，当这种致敏粒子与样本血清作用时，若样本中含有抗心拟脂抗体(反应素)结合，形成肉眼可见的红色凝集反应。（二）试剂和器材1.梅毒甲苯胺红不加热血清试验诊断试剂(TRUST)包括TRUST抗原悬液、阴阳性对照血清、试验专用卡片、专用滴管及针头。有商品供应。2.0.9％生理盐水。3.待测血清临床筛选获得。4.器材可调移液器(10～100μl)、加样吸嘴、冰箱等。（三）操作方法1．定性试验(1)分别吸取梅毒阳性对照、阴性对照和待检血清或血桨(不需灭活)50μl均匀铺加于纸卡的三个圆圈中。(2)用专用滴管及针头垂直分别滴加TRUST试剂1滴于上述血清中。(3)按100r/min摇动8min，肉眼观察结果。操作方法2．定量试验将待检血清用生理盐水作倍比稀释，然后按上述定性方法进行试验，以呈现明显凝集反应的最高稀释度作为该血清的凝集效价。（四）结果判断1.阳性反应(+++～++++)：可见中等或较大的红色凝聚物。2.弱阳性反应(+～++)：可见较小的红色凝聚物。3.阴性反应(－)：可见均匀的抗原颗粒而无凝聚物。（五）注意事项1.本试验在23～29℃条件下进行。2.TRUST试剂使用前应充分摇匀。3.本试验系非特异性反应，需结合临床进行综合分析，必要时需作梅毒螺旋体抗体特异性试验。五、实验讨论与思考题凝集反应只有在抗原抗体比例适当时，才能出现肉眼可见的反应。一般情况下，随着血清浓度的逐渐稀释，凝集反应越来越弱，但在抗体浓度过高时，反而无凝集现象出现，此为前带现象。出现该情况时，须加大抗体稀释倍数重新试验。实验方法学评价：①由于抗原抗体反应的血清学试验方法检测灵敏度具有一定的局限性，所以本试剂检测结果只能提示血清或血浆中有无TP抗体存在，而不能作为临床诊断的唯一标准。②TP抗体检测阴性的样品并不能排除梅毒感染的可能。实验讨论与思考题通过本试剂判定为TP抗体阳性或可疑时，需经过一段时间再进行复查，并与其他检查结果和临床症状结合起来加以综合判断。1.TRUST和TPPA是否是特异性实验？为什么？2.TPPA阳性可以确诊TreponemaPallidum吗？TPPA阴性可以排除TreponemaPallidum诊断吗？为什么？实验讨论与思考题下次课预习内容实验三设计性实验设计性实验的开题报告和技术路线。