邻苯三酚法测定SOD酶活

邻苯三酚法测定SOD酶活—修改的Marklund方法1、本方法检出限1.17U/ml.2、定义：25℃时抑制邻苯三酚自氧化速率50%时所需要的SOD酶量为一个酶活力单位。3、原理：在碱性条件下，邻苯三酚会发生自氧化生成红橘酚，同时生成O2-，连苯三酚的自氧化速率与O2-的浓度有关。SOD能催化O2-发生歧化反应生成H2O2和O2，从而抑制连苯三酚的自氧化。样品对连苯三酚自氧化速率的抑制率，可反映样品中的SOD的含量。4、试剂4.1A液：pH8.20、0.1mol/lTris-HCl缓冲溶液（内含1mmol/LNa2EDTA）。称取1.2114gTris和37.2mgNa2EDTA溶于62.4ml的0.1mol/L盐酸溶液中，用蒸馏水定容至100ml。4.2B液：4.5mmol/L邻苯三酚盐酸溶液。称取邻苯三酚（A.R）56.7mg溶于少量10mmol/l盐酸溶液，并定容至100ml。4.310mmol/l盐酸溶液。4.40.200mg/ml超氧化物歧化酶。4.5蒸馏水。5、样品制备样品测定前需离心，取上清液测定。6、分析步骤6.1邻苯三酚自氧化速率测定：在25℃左右，于10ml比色管中依次加入A液2.35ml，蒸馏水2.00ml，B液0.15ml，加入B液立即混合并倾入比色皿，分别测定在325nm波长条件下初始时和1min后吸光值，二者之差即邻苯三酚自氧化速率△A325（min-1），本实验确定△A325（min-1）为0.060。6.2样液和SOD酶液抑制邻苯三酚自氧化速率测定按以上步骤分别加入一定量样液或酶液使抑制率约为1/2△A325（min-1），即△A’325（min-1）为0.030。SOD活性测定加样程序见表1。表1SOD活性测定加样表试液空白样液SOD液A液/ml2.352.352.35蒸馏水/ml2.001.801.80样液或SOD液/μl200μl200μlB液/ml0.150.150.157、结果式中：U/ml——SOD酶活力单位；△A325——邻苯三酚自氧化速率；△A’325——样液或SOD酶液抑制邻苯三酚自氧化速率；V——所加酶液或样液体积，单位为毫升（mL）；D——酶液或样液的稀释倍数；4.5——反应液总体积，单位为毫升（mL）。计算结果保留三位有效数字。8、精确性在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。