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构建表达载体的实验流程及其注意事项中国农业大学梁荣奇2把目的基因置于以适当的载体，转化细菌后，筛选所需的细菌克隆。摇菌后可得到大量含目的基因的表达载体注意事项：--选择合适的载体--载体具有适合的酶切点--适合地连接反应--选择适合扩增质粒的菌株--筛选、验证目的克隆--转化对照3分子克隆实验若纸上谈兵，似乎轻而易举；但要付诸实践，却又举步维艰，谈何容易。大多数实验都是步骤繁多，若一着不慎，即会陷入困境。验证每步产物，设置对照以检查每一反应的效率，都是可取的良策。而要对上述问题应对自如，又必须透彻理解每一步实验流程所涉及的实验原理。——第一版前言（p11）《分子克隆实验指南》第二版，1996，科学出版社4汇报内容1表达载体的分类2目的基因的获得3酶切4片段回收5连接6质粒的检测5如何阅读质粒图谱1、质粒类型和大小（真核/原核/穿梭质粒）2、复制起点（ori）3、筛选标记（抗生素标记）4、多克隆位点（MCS）5、外源DNA片段的插入（位置、大小、酶切位点）6、表达系统元件（启动子—核糖体结合位点/内含子—克隆位点—转录终止信号）6781、杀菌机理：四环素（tet):四环素与核糖体30S亚基结合，抑制核糖体的转位。Tet抗性基因编码一个399的膜结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。氨苄青霉素（amp)：氨苄青霉素可与细菌膜上一些与细胞壁合成有关的酶结合并抑制其活性。Amp基因可降解氨苄青霉素。氯霉素（Cm或cat)：氯霉素与核糖体50S亚基结合并抑制蛋白质的合成。Cat基因编码一个四聚体细胞蛋白，催化氯霉素羟乙酰氧衍生物的形成。卡那霉素（kan)：可与核糖体结合，抑制蛋白的合成。卡那霉素可被氨基糖苷磷酸转移酶(APH-II)灭活。2、溶液配制：一般配成50或100mg/mL，抽滤，-20℃保存备用。常用抗生素抗性基因9遗传转化所用载体（1）一、基因枪转化1、对载体类型无选择；2、载体不宜过大，目的基因不宜过大。3、可以转化“启动子-目的基因-终止子”片段。二、农杆菌转化1、农杆菌载体，含有左右边界；2、可以转化大的目的基因。10候选基因功能分析一、超表达载体1、CaMV35S启动子；2、玉米Ubi启动子；3、其它。二、RNAi载体1、含有intron，转录后形成发卡，沉默效率高；2、多用其本身启动子。11汇报内容1载体的分类2目的基因的获得3酶切4片段回收5连接6质粒的检测12一、克隆位点的选择1、首先要对目标基因进行酶切位点扫描分析，列出其所含酶切位点清单。2、然后对照质粒多克隆位点，所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位点。二、保护碱基数（直接酶切PCR产物）1、在设计PCR引物时，引入酶切位点后，常常要加入保护碱基。2、一般情况下，普通的内切酶只加入两个保护碱基，其内切反应就可以正常进行；有些则加3个以上，NdeI就属这类，需加入至少6个保护碱基，常用的HindIII也要三个。13目的基因获得一、从已有载体上截取所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位点二、PCR法1、无内含子，可用基因组DNA为模板，有内含子则用cDNA。2、若PCR难度很大，宜将PCR产物连到克隆载体上，测序后，再酶切连接到表达载体上。不推荐直接酶切PCR产物。3、在加loadingbuffer前，可取出几微升，作为二扩模板。4、设退火温度梯度，多做几管。回收时损失大半。5、尽管PCR产物只有一条特异带，电泳挖取目标带也是必要的。三、人工化学合成最后的选择。公司会将合成片段连入克隆载体。需测序验证。14汇报内容1表达载体的分类2目的基因的获得3酶切4片段回收5连接6质粒的检测15基因工程所用的酶限制性内切酶从商品目录上得到有关信息GAATTCCTTAAGEcoRIGCTTAA5’p5’pCTGCAGGACGTCPstICTGCAG5’p5’p3’OH3’OH3’OH3’OH注意：1、不同公司的酶，其缓冲液有时是不同的；2、同一公司的酶，使用相同的缓冲液或不同的缓冲液而不显著影响酶活性时，可同时做双酶切。3、一种酶可能有几种缓冲液。CCCGGGGGGCCCSmaI16酶的质量标准酶活单位：酶量，时间酶的浓度：10units/uL;20uints/uL等保存条件:-20～-30℃切割位点：有无其他活性酶切体系:buffer及与其它酶双切的buffer等所用底物：DNA量，切后再连接的程度反应温度：一般为37℃,但许多酶对温度有特殊要求甲基化：星活性:所加酶量过多保护碱基:怎样使用公司目录不同酶的反应缓冲液及活性双酶切酶切后具有共同的粘性末端17核酸酶操作注意事项通常，不同公司出产的内切酶，它的菌株来源、制备工艺、纯度及活力、酶切活性的优化等都可能存在不同，试剂公司会对自己的内切酶进行比较全面的分析。因此，说明书及目录中的技术资料是最具有针对性的资料。注意事项：a.内切酶如无特殊要求，应该保存在-20~-30度。温度过低：酶会冻结，反复冻融，降低酶活温度过高：b.酶在使用时应置于冰盒中取酶。不可用手捏管底部移液器吸取时，酶管不可离开冰面。c.酶使用完后应尽快旋紧盖子。d.吸取酶时的tips，最好是长些。18内切酶buffer盐离子低--中--高通用promegaA—B—C—D……TaKaRaL—M—HKNEB1—2—3—4……1、双酶切时注意buffer的选择；2、酶在非最优buffer中的活性会降低，应调整酶量和反应时间。19一）酶切不开或酶切不完全？？1、质粒不纯：杂蛋白（A260/A280＜1.8）；抑制剂（酚、盐、乙醇）2、酶失活：有过期时间（能有效酶切，可继续使用）；存放、使用不当3、buffer：是否充分化融；双酶切4、保护碱基：5、甲基化：甲基化缺陷的菌株20二）酶切后电泳时出现smear？？1、内切酶含量过高内切酶含量＜酶切体系的10％2、星活性：甘油浓度、离子浓度、反应温度、酶含量、反应时间3、污染：其它的DNA、其它的内切酶或DNA酶21汇报内容1表达载体的分类2目的基因的获得3酶切4片段回收5连接6质粒的检测22过柱法回收1、PCR产物带2、酶切片段注意：1）电泳的带要亮：要求PCR体系、酶切体系要大。2）柱子上的树脂吸附能力有限3）尽量让酒精等挥发彻底，以免影响后续的连接反应。4）凝胶回收试剂盒是否失效（盐离子浓度：KI）5）洗脱液体积一定大于临界值。预热。23汇报内容1表达载体的分类2目的基因的获得3酶切4片段回收5连接6质粒的检测24连接反应1、连接方法1）4℃，2-3d：酶活低，粘性末端的氢键结合稳定2）37℃，2hr：酶活高，氢键结合不稳定。5×ligationbuffer3）16℃，过夜：发挥酶活性，兼顾粘性末端短暂配对结构的稳定2、反应体系10×ligationbuffer1.0μLT4ligase（5U/μL）0.2μL载体片段目的片段灭菌的双蒸水补足到10.0μL25注意：1、一定要检测回收效果，带亮（浓度高）方可用于下一步连接。通常，重组分子只有几十万分之一。回收片段中无酒精等影响连接的残留。2、将目标片段、载体片段的泳道相邻，根据亮度估测其浓度。连接时，目的：载体=3：1（分子个数）别忘记长片段插入的EB多。分子个数一样多时，长片段更亮。3、如果是单酶切，为了防止载体自身环化，可以用牛小肠碱性磷酸酶（CIP）处理，去掉酶切后5‘端的磷酸。酶切结束，向酶切体系中加入1.0μLCIP，37℃0.5-1hr即可。4、对照质粒生长，而连接产物转化不成功，这说明你的连接是不成功。5、连接液不能反复多次冻溶，因为里面含有ATP。建议不要使用生产日期不明的连接酶和连接液（看似很会过日子，实际是个败家子）。26汇报内容1表达载体的分类2目的基因的获得3酶切4片段回收5连接6质粒的检测27热激转化1.手持冰盒到-80℃冰箱前，取出感受态管，插入冰中。2.手指捏感受态管底2-4sec使其融化后，加入连接产物，枪尖温和搅匀，于冰上30min。3.42℃水浴90sec（一定要准确，不要时间过长）。4.冰浴２min后，加入800μL的LB在37℃振荡30～45min。5.取200μL涂布于含Amp(50μg/mL)等相应抗生素的平板，37℃培养过夜，观察结果6.将150mL锥形瓶中放入5～10mL培养基，加入抗生素，挑取菌斑，250转/min振荡培养过夜。（摇菌前可先做菌液PCR）7.提取质粒，电泳，酶切28重组质粒筛选1、抗生素筛选法2、互补法蓝白斑筛选：PUC系列载体含有β－半乳糖苷酸基因（lacZ）的调控序列和头１４６个氨基酸偏码区。DH5α含编码β－半乳糖苷酶Ｃ端ａａ的序列。3、PCR、酶切29质粒提取：碱裂解法收获细菌：含有质粒的DH5α、TOP10等LB可富集2-3次，Teriffic可2次。溶液Ⅰ：Tris-HCl,EDTA,葡萄糖溶液Ⅱ：NaOH,SDS冰上3-5min，时间过长会：质粒断裂；羟基化影响酶切溶液Ⅲ：乙酸钾，冰乙酸迅速颠倒3次混匀后，置于冰上TER：（TE，pH8.0，含RNase20μg/mL）去除RNA30质粒纯化：1、PEG纯化缺点：摇菌液几百毫升，耗时长，步骤繁多优点：质粒纯度高（不含线状DNA）浓度大2、过柱法：缺点：柱子吸附能力有限，浓度低，纯度差（甚至有RNA）优点：省时省力31质粒的电泳Marker是酶切片段；质粒是环形的，还会形成超螺旋结构。32质粒验证1、酶切验证一般将质粒切成2-3个片段，片段大小是否相符？如：连接后酶切的载体片段、目标片段大小与连接前相同？2、PCR验证如：用目的基因引物扩增，检查目的基因是否存在3、测序验证最后的选择。332012-03-15世间无难事，只怕有心人。