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第二节细胞周期的调控MPF的发现及其作用细胞周期运转的调控卵细胞促成熟因子,matuation-promotingfactor细胞促分裂因子,mitosis-promotingfactorM期促进因子,M-phase-promotingfactor一、MPF的发现及其作用Johnson和Rao(1970)将Hela细胞同步于不同阶段，然后与M期细胞混合，在灭活仙台病毒介导下，诱导细胞融合。结果----------使间期细胞出现类似于有丝分裂期的形态变化：染色质凝集，核被膜破裂及核仁消失，将这种现象叫做染色体超前凝集(prematurechromosomecondensation)。Meaning?M期细胞具有某种促进间期细胞进行分裂的因子，即细胞分裂促进因子(maturationpromotingfactor，MPF)。人M期细胞与袋鼠（Ptk）G1、S、G2期细胞融合诱导PCC卵细胞提取物注射实验Masui和Markert在体外用孕酮诱导非洲爪蟾的卵母细胞成熟Meaning?：孕酮诱导卵母细胞成熟；成熟卵细胞质中，含有卵母细胞成熟的因子，即促成熟因子MPF（maturationpromotingfactor）。用成熟卵母细胞的细胞质注射到卵母细胞，发现可以促进卵母细胞成熟。1988年Maller实验室的J.Lohka纯化了爪蟾的MPF，经鉴定由32KD和45KD两种蛋白组成，二者结合可使多种蛋白质磷酸化。MPF的纯化细胞周期基因的发现LelandHartwell七十年代初，美国西雅图的华盛顿大学LelandHartwell，以芽殖酵母为实验材料，利用阻断在不同细胞周期阶段的温度敏感突变株，分离出了几十个与细胞分裂有关的基因(celldivisioncyclegene，cdc)。他发现的一群基因，成为八十年代和九十年代人们研究细胞周期的主要对象。如芽殖酵母的cdc28基因，在G2/M转换点发挥重要的功能。也在七十年代，英国牛津大学的PaulNurse，用另外一种酵母裂殖酵母为实验材料，同样发现了许多细胞周期调控基因，如：裂殖酵母cdc2；通过对它们的分子生物学和生物化学研究，进一步的研究发现cdc2和cdc28的都编码一个34KD的蛋白激酶。这个酶的激活和失活调控细胞周期运转，特别是G2/M期转变。但研究者很快发现，p34cdc28或p34cdc2单独并不具有激酶活性，需要同相关蛋白结合后才具有活性（如p34cdc2和蛋白p56cdc13结合）。PaulNurse和美国科罗拉多大学的Maller合作证明（1990）证明P32实际上是CDC2的同源物。1983年英国的汉特实验室TimothyHunt发现海胆卵受精后，卵裂过程中两种蛋白质的含量随细胞周期剧烈振荡，在每一轮间期开始合成，G2/M时达到高峰，M结束后突然消失，下轮间期又重新合成，故命名为周期蛋白(cyclin)。细胞周期蛋白(cyclin)的发现•TimHunt和Maller合作证明P45是cyclinB的同源物，从而将细胞周期三个领域的研究联系在一起。PaulNurse(human-yeastgenes);TimHunt(cyclin)●催化亚基活性有赖于周期蛋白，故蛋白称为周期依赖性蛋白激酶(cyclin-dependentproteinkinases,Cdks);●调节亚基：周期蛋白(cyclin)。MPF的结构组成由两个不同的亚基组成的异质二聚体:LelandH.HartwellR.Timothy(Tim)Hunt2001年诺贝尔生理学与医学奖授予了美国科学家LelandHartwell和英国科学家蒂TimHunt、PaulNurse，以表彰他们发现了细胞周期的关键调节机制。三、周期蛋白自发现周期蛋白后，在不长的时间里有数十种周期蛋白被克隆和分离。如酵母的Cln1,Cln2,Clin3,Clb1-Clb6，在脊椎动物的A1-2、B1-3、C、D1-3、E1-2、F、G、H等。周期蛋白框，介导周期蛋白与CDK结合.M期G1期不同周期蛋白的表达时期不同，与不同的CDK结合，调节不同CDK激酶的活性。部分哺乳动物和酵母细胞周期蛋白在细胞周期中的积累及其与CDK激酶活性的关系。脊椎动物激酶复合体CyclinCDKG1-CDKCyclinD*CDK4、6G1/S-CDKCyclinECDK2S-CDKCyclinACDK2M-CDKCyclinBCDK1(CDC2)•已知30余种，在脊椎动物中为A1-2、B1-3、C、D1-3、E1-2、F、G、H等。分为4类：G1型、G1/S型、S型、M型。不同类型的CDK/cyclin复合体四、CDK激酶和CDK激酶抑制物在酵母cdc2和cdc28基因被分离后，几个实验室同时工作构建了人类、爪蟾和果蝇的cDNA文库，得到了一系列与cdc2相关的基因。他们有两个共同的特点，一是含有一段类似的氨基酸序列，二是都必须和细胞周期蛋白结合才具有激酶的活性，故名细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependentkinase，CDK)。已经命名的CDK激酶包括：CDK1-8。cdc2最早被发现，被命名为CDK1。各种CDK分子都含有一段类似的CDK激酶结构域，其中一段PSTAIRE的序列相当保守，与周期蛋白的结合有关。另外，一些位点的磷酸化与激酶的活性有关。•动物中已知7种CDK，均含有一段相似的保守序列即PSTAIRE，与周期蛋白的结合有关。CDK激酶类似的CDK蛋白分子图解时相蛋白激酶周期蛋白G2→MCdk1周期蛋白A，BG1→SCdk2周期蛋白ESCdk2周期蛋白A?Cdk3?G1Cdk4周期蛋白D1，D2，D3G1Cdk5周期蛋白D1，D2，D3G1Cdk6周期蛋白D1，D2，D3哺乳动物细胞周期蛋白与周期蛋白依赖性蛋白激酶这类蛋白激酶常以磷酸化的形式直接作用于细胞周期，包括DNA合成的启动和终止，核膜、核仁的崩解和重新形成，核纤层的降解和重新聚合，纺缍体的形成和消失等。它们可根据作用的时期不同分为G1、G1/S、S期CDK，及M期CDK。细胞中还具有细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子（CDKinhibitor，CDKI）对细胞周期起负调控作用，目前发现的CDKI分为两大家族：①Ink4(Inhibitorofcdk4)，如:P16ink4a、P15ink4b、P18ink4c、P19ink4d，特异性抑制cdk4·cyclinD1、cdk6·cyclinD1复合物。②CIP/Kip(Kinaseinhibitionprotein)：包括P21cip/waf1(cyclininhibitionprotein1)、P27kip1(kinaseinhibitionprotein1)、P57kip2等，能抑制大多数CDK的激酶活性，P21cip/waf1还能与DNA聚合酶δ的辅助因子PCNA（proliferatingcellnuclearantigen）结合，直接抑制DNA的合成。细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子Cdkactivitycanbesuppressedbothbyinhibitoryphosphorylationandbyinhibitoryproteins(CKIs).P27—Cdkinhibitorproteins(CKIs)蛋白激酶的活性可以受到某些激酶的磷酸化作用所抑制，脱磷酸而有活性。二、细胞周期运转调控CDK激酶对细胞周期起着核心性的调控作用。不同种类的周期蛋白和不同种类的CDK结合,构成不同的CDK激酶。不同的CDK激酶在细胞周期的不同时期表现出活性,因而对细胞周期的不同时期进行调节。Cdkassociatessuccessivelywithdifferentcyclinstotriggerthedifferenteventsofthecycle.Cdkactivityisusuallyterminatedbycyclindegradation.酵母细胞周期的调控哺乳动物细胞周期的调控哺乳动物的细胞周期受一个小型Cdks家族的调节。在哺乳动物细胞周期中起作用的Cdks,Cdk1、Cdk2、Cdk3…等。哺乳动物细胞中也能表达多种周期蛋白:周期蛋白A、B、D和E。（一）G2/M期转化与CDK1激酶的关键性调控作用CDK1激酶（p34cdc2激酶），由p34cdc2蛋白（或p34cdc28蛋白）与周期蛋白B组成。CyclinB的合成在G2/M时达到高峰，随着M期的结束而发生降解，细胞从G2期向M期的转变受此蛋白的调节。周期蛋白在CDK1激酶活性调节中的作用CDK1激酶的激活促进细胞进入分裂期在S期,Weel1活性高，可以促进Thr14和Tyr15的磷酸化，Cdc25ｃ活性低。在Ｇ２期Cdc25ｃ活性增强，促进Thr14和Tyr15的去磷酸化CAK=CDK1-ActivitingKinase细胞中CDK激酶的活性受到多种因素的调控CDK1激酶催化不同的底物（主要是磷酸化丝氨酸和苏氨酸），参与细胞的多种功能。cyclinB/A与CDK1结合，CDK1使底物蛋白磷酸化、如将组蛋白H1磷酸化导致染色体凝缩，核纤层蛋白磷酸化使核膜解体等下游细胞周期事件（二）M期周期蛋白与分裂中期向分裂后期转化细胞周期运转到中期后，M期周期蛋白A和B降解，CDK1激酶活性丧失，蛋白去磷酸化，由中期向后期转化。M期周期蛋白N端有破坏框。在中期当MPF活性达到最高时，通过一种未知的途径，激活泛素酶复合物，将泛素连接在M期周期蛋白上，导致其被蛋白酶体降解.1.泛素的羧基端通过与泛素激活酶(E1)的半胱氨酸残基形成硫酯键而激活。2.泛素从E1转移到泛素结合酶(E2)的半胱氨酸残基。3.E2和泛素连接酶(E3)一起将泛素转移到底物蛋白的赖氨酸残基,在那里进行泛素的聚合化,最后作为蛋白酶体的降解底物,被快速降解。泛素加到周期蛋白上需要三种不同的酶介导:泛素连接酶(E3)又称为后期促进复合物(anaphase-promotingcomplex,APC)至少有8种成分组成，分别称为APC1至APC8。APC可以促使M期周期蛋白泛素化途径降解，此外也调节其他一些与细胞周期调控有关的非周期蛋白类蛋白质的降解。后期促进因子APC活性的受到多种调节。首先，APC活性受MPF的调节。其次，APC受到Cdc20的正调控；Cdc20位于染色体的动粒上.在未被被动粒微管捕捉的动粒上Mad2蛋白与Cdc20结合抑制其活性若动粒被动粒微管捕捉,则Mad2从动粒上消失,对Cdc20的抑制解除,促使APC活化，纺锤体装配不完全，或所有动粒不能被动粒微管全部捕捉，APC则不能被激活。纺锤体装配检验点（三）G1/S期转化与G1期周期蛋白依赖性CDK激酶细胞由G1向S期转化受G1期周期蛋白依赖性激酶所控制：G1期激酶：CDK4、CDK6G1期周期蛋白：cyclinD,E。cyclinD的合成对细胞生长因子有强烈的依赖性RbbindwithE2FtranscriptionfactorRb是G1/S期转化的负性调控因子,在G1晚期通过磷酸化而失活Rb蛋白磷酸化→与之结合的转录因子（E2F）释放→S期所需的基因转录的阻断被解除→细胞进入S期；Rb蛋白为视网膜母细胞瘤（retinoblastoma，Rb）基因编码周期蛋白E与CDK2结合，使之激活,使与RB类似的蛋白质底物p107磷酸化而解除其对E2F的抑制作用，促进细胞通过G1/S限制点而进入S期。周期蛋白E在G1晚期表达,进入S期后降解.除G1期周期蛋白依赖性CDK激酶外,细胞内还存在其它的多种因子对DNA复制起始活动的调节.复制起始点识别复合体（Originrecognitioncomplex,ORC），识别并结合DNA复制起始点是DNA复制所必须的.一、名词：细胞周期、中期中细胞、静止期细胞、终末分化细胞、联会、联会复合体、MPF、PCC、周期蛋白、CDK二、问答：1什么是细胞周期？细胞周期各时期的主要变化是什么？2细胞周期同步化有哪些方法？比较其优缺点。3细胞通过什么机制将染色体排列到赤道板上？4说明细胞分裂后期染