万古霉素产生菌的分离及育种

技术路线图实验内容研究背景近年来，由于链霉菌中大量的抗生素不断被重复发现，继而人们把研究的重点转向稀有放线菌(rareactinomycetes)。拟无枝酸菌属（Amycolatopsis)就是一类非常重要的稀有放线菌，产生万古霉素和利福霉素等重要临床药物，以及其他抗菌、抗肿瘤等代谢产物。万古霉素（vancomycin）是由McCormick等于1955年从一株东方拟无枝酸菌（A.orientalis）的发酵液中分离得到的一种糖肽类抗生素。它能够抑制革兰氏阳性菌的生长，而对厌氧菌和革兰氏阴性菌无效。1958年获FDA批准上市.它是治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和耐甲氧西林表皮葡萄球菌（MRSE）等引起的严重或致命感染的重要药物，对多重耐药性肠球菌感染性疾病也有突出疗效.随着对链霉菌的广泛筛选，大量生物活性物质被重复发现，从链霉菌得到新的生物活性物质的几率逐渐下降．因此，那些用常规方法较难分离到的稀有放线菌逐渐被重视，获得这些新型菌株可避免对产生已知生物活性物质的常见菌株的重复分离。稀有放线菌的分离成为获取新抗生素的重要途径之一，也是获得新种属和新物质的重要手段．通过利用菌株的形态特征、生理生化特性和分子生物方法从土壤中分离万古霉素产生菌，并采用育种技术选育具备工业化潜力的万古霉素高产菌株，为进一步研究奠定基础。实验材料1.万古霉素产生菌：东方拟无枝酸菌ＸＭ０３０１由本实验从厦门集美土样中分离．2.指示菌：枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌购自中国医学细菌保藏管理中心．3.培养基枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌：ＬＢ培养基。拟无枝酸菌分离培养基：高氏一号培养基（含有万古霉素５０ｍｇ／Ｌ、重铬酸钾５０ｍｇ／Ｌ和制霉菌素５０ｍｇ／Ｌ），ＸＭ０３０１发酵培养基实验步骤一出发菌株获取1.菌株的分离筛选•样品采集土壤样品采自厦门海沧（１）和集美（２）•富集培养称取样品，加入无菌水，制成土壤悬浊液，梯度稀释．分别取各个梯度稀释样品采用混菌法制成分离平板，２８℃培养．•分离筛选挑取分离平板上的放线菌菌落，用划线法转接到新鲜的无菌高氏平板，２８℃恒温箱培养，形成纯的单菌落后再转接到新鲜高氏斜面培养保藏。结果通过利用制霉菌素、重铬酸钾和万古霉素分别抑制真菌、细菌和链霉菌等杂菌生长，高效地富集稀有放线菌，从来自厦门集美的２号土样中分离出XM0301，在高氏培养基上为草帽型放射状菌落，白色孢子。2.菌株鉴定•观察菌丝形态、产孢结构和孢子形态分离菌株形态特征于葡萄糖天冬酰胺琼脂、马铃薯浸汁琼脂、高氏一号琼脂和ＹＥＭＥ培养基上２８℃插片培养５～７ｄ，镜检。•１６ＳｒＤＮＡ鉴定设计引物进行PCR扩增，纯化PCR产物并测序。序列用NCBIblast,与GenBank相关序列比对分析。•结果见表1和表23.生物活性鉴定•采用抑菌圈法，分别以枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌为指示菌，测定分离菌株发酵液抗菌活性．综合培养、形态、生理和生化等特征，初步判定筛选的XM0301为拟无枝酸菌属，进一步测定其16SrDNA序列［NCBI登录号为DQ990889］，与无枝酸菌属相似性达100％，比对分析结果表明XM0301为一株东方拟无枝酸菌。4.产物鉴定•根据Ｄｉａｎａ等方法修改设计ＨＰＬＣ条件，以Ｓｉｇｍａ公司盐酸万古霉素为标样分别采用保留值法和内标法对XM0301发酵产物进行HPLC测定．•通过ＨＰＬＣ分析，ＸＭ０３０１发酵液主要产物保留时间为6.2min左右（图Ｂ），与万古霉素标准样品的保留时间一样（图Ａ）．进一步采用内标法比较分析，在XM0301发酵液中添加万古霉素为内标后，6.2min峰强度明显增强，其他各峰基本不变，XM0301的主要产物为万古霉素，含量为860μｇ/mL（Ｂ、Ｃ）.实验步骤二获得高产菌株通过育种技术提高万古霉素产生菌株的产量和产率，是获得更大经济效益的另一途径．本文采取原生质体诱变和基因组改组（基因组重排）技术选育万古霉素高产菌株。基因组改组技术是结合经典诱变育种和原生质体融合技术发展起来的一种育种新手段，在诱变产生遗传多质性的基础上，通过多亲本原生质体融合，使带有不同基因位点正向突变的数个亲本杂交，基因重组产生新的复合子，然后进行筛选，最后获得具有多重正向进化标记的高效菌株．1.原生质体诱变•发酵培养基初步调整将XM0301菌种接种到不同发酵培养基，采用滤纸法比较活性物质产量。结果表明，１号发酵培养基营养丰富，发酵产物最高，而且均匀无沉淀，便于大量突变菌株产量比较和筛选，故后续育种实验中XM0301均采用１号发酵培养基．•XM0301原生质体制备根据Kieser等方法修改：冷藏菌种用高氏一号斜面活化,28℃培养，在培养过程中加入甘氨酸（有利于溶菌酶渗透和增强细胞壁水解作用）进行预处理。加入溶菌酶和溶壁酶水解放线菌细胞壁。•ＸＭ０３０１原生质体诱变参考Kieser等方法修改：调整原生质体浓度，确定合适的诱变剂量，加入NTG诱变。采用离心法终止诱变反应。•筛选高产菌株-浓度梯度法用双层法制成浓度梯度平板，在高浓度区域长出的菌落具备抗生素高产性能。最终从原生质体诱变再生平板上随机分离了10464个突变菌株．2.基因组改组（基因组重排）•原生质体融合选择诱变高产菌株为亲本进行基因组改组，各亲本菌株制备原生质体，分别用紫外或加热灭活亲本原生质体后等比例混合各亲本原生质体，用PEG作为融合剂，室温下融合，Ｐ液梯度稀释后再生，分离再生改组菌落，测定各菌株活性筛选高产菌株．•突变菌株小量发酵将突变菌株分别接种到液体培养基上，进行振荡培养（摇瓶培养更接近发酵罐培养的条件，结果比较一致，易于筛选到合适的菌株）。3.后期筛选•高通量筛选模型-琼脂平板活性圈法首先准备一块玻璃板，用含有枯草芽孢杆菌的琼脂在玻璃框上制备平板，然后将含有相应的突变菌株发酵液的牛津杯放置在琼脂平板上，培养。最后测定各样品抑菌圈大小．通过比较各样品抑菌圈大小，可以快速筛选出产量提高的高产突变菌株．完整的筛选过程参见下图：万古霉素产生菌育种筛选流程图