罗氏HE4试剂性能评估综述---刘万里主任

罗氏HE4试剂性能评估综述中山大学附属肿瘤医院刘万里内容•罗氏HE4检测原理•Elecsys®HE4SFDA注册研究概况•Elecsys®HE4性能评估•Elecsys®HE4性能小结内容•罗氏HE4检测原理•Elecsys®HE4SFDA注册研究概况•Elecsys®HE4性能评估•Elecsys®HE4性能小结标记免疫电化学发光检测ECL(IA)Technology•EElectro•CChemo•LLuminescence•IImmuno•AAssay••方法、仪器、试剂三位一体的特定自动化分析，系统解决了大规模样本检测稳定、高效、快速等问题。是医学超微量分析的一次战略性革命RocheHE4检测试剂设计双抗体夹心一步法•原理：双抗体夹心法•检测时间：18分钟•1st孵育:９分钟10µL血样,生物素标记HE4特异性单克隆抗体，钌标记HE4特异性单克隆抗体，形成抗原抗体复合物•2nd孵育:９分钟•加入链酶亲和素包被的磁珠，通过生物素和链酶亲和素反应，形成复合物•检测:反应复合物送入测量池，磁珠结合至电极表面，未结合的反应物通过ProCell清除•通过对电极增加电压触发化学发光光电子释放，后者通过光电倍增管检测RocheHE4检测试剂设计HE4检测原理生物素标记的HE4单克隆抗体Ru待检样本中的HE4(10μL)钌标记的HE4单克隆抗体Ru链酶亲和素包被的磁珠Ru进行检测9min9minRocheHE4试剂成分试剂–工作溶液•M:包被链酶亲和素的微粒（透明盖），1瓶，6.5mL：包被链霉亲和素的微粒0.72mg/mL；防腐剂•R1:生物素化抗人HE4抗体（灰盖），1瓶，10mL：生物素化单克隆抗HE4抗体（小鼠）0.75mg/L，磷酸盐缓冲液100mmol/L，pH值6.5；防腐剂•R2:钌复合物标记的抗人HE4抗体（黑盖），1瓶，10mL：钌复合物标记的单克隆抗HE4抗体（小鼠）1.5mg/L；磷酸盐缓冲液100mmol/L，pH值7.4；防腐剂RocheHE4试剂成分需要的材料试剂名称货号规格ElecsysHE405950929190100测试ElecsysHE4CalSet059509451904x1mLPreciControlHE4059509531902x1mLeachofPreciControlHE41and2试剂名称货号规格ElecsysCA125II11776223322100testsperrackpackElecsysCA125IICalSet117762403224x1mLPreciControlTumormarker117764521222x3mLeachofPreciControlTumormarker1and2卵巢癌肿瘤标志物提供HE4和CA125检测的厂家HE4CA125Roche(Elecsys,cobase)Abbott(Architect)Beckman(Access)Siemens(Immulite,Centaur,Vista)Diasorin(Liaison)B.R.A.H.M.S(Kryptor)BectonDickinson(TriPath)plannedCanAg（ELISA）罗氏所有免疫平台均可以同时提供CA125和HE4的检测内容•罗氏HE4检测原理•Elecsys®HE4SFDA注册研究概况•Elecsys®HE4性能评估•Elecsys®HE4性能小结Elecsys®HE4SFDA注册研究研究概况•研究时间：2011.1~2011.6•研究中心中国医学科学院肿瘤医院浙江大学医学院附属妇产科医院华中科技大学同济医学院附属同济医院山西省肿瘤医院Elecsys®HE4SFDA注册研究•研究目的一：与康乃格公司HE4(酶联免疫法)进行比对检测，评价试验结果•研究目的二：盆腔肿块患有卵巢癌风险的评估：ElecsysHE4和Elecsys125II联合检测计算ROMA指数，评估风险高低•研究目的三：血清,血浆对比试验，验证不同类型样本结果的一致性Elecsys®HE4SFDA注册研究结果共入组1487例样本标本类型医科院肿瘤浙大妇产武汉同济山西肿瘤合计卵巢上皮癌103494045237疑似样本（盆腔包块患者）611916868388其他肿瘤（子宫内膜癌、肺癌、乳腺癌、消化道癌、膀胱癌等）621363648282表观健康人群12012511082437RF阳性111091040溶血1010101141脂血1011101142黄疸10001020合计3875322832851487Elecsys®HE4SFDA注册研究结果各研究中心不精密度结果CV（低浓度）CV(中浓度)医科院肿瘤医院2.21%4.35%浙江大学妇产医院1.05%1.11%武汉同济医院1.06%0.62%山西省肿瘤医院1.61%0.66%选取中、低浓度的样品各一份，分别检测10次，计算CV值Elecsys®HE4SFDA注册研究结果各研究中心质控结果良好参比试剂考核试剂CA125医院名称质控名称HE4质控名称PreciControlHE4质控名称PCTM质控批号2796427092270931560800015608100靶值47.5pmol/L391.5pmol/L45pmol/L341pmol/L32.6(U/mL)101(U/mL)范围33-62313-47035.0-53.6262–40225.76~39.4479.79~122.21医科院肿瘤检测结果43.78447.446.18340.828.7101.7浙大妇产检测结果41.34367.7447.8344.529.0280.24武汉同济检测结果39.59360.542.7432133.6291.94山西肿瘤检测结果50.98441.7143.43343.932.9686.91Elecsys®HE4SFDA注册研究结果与参与试剂有良好的一致性y=1.0942x+2.7976相关系数r＝0.949回归系数R2＝0.8997Elecsys®HE4SFDA注册研究结果ROMA指数可将盆腔肿块患者进行风险分级绝经前:PI=-12,0+2,38*LN[HE4]+0,0626*LN[CA125]绝经后:PI=-8,09+1,04*LN[HE4]+0,732*LN[CA125]•582例样本被正确分入高/低风险组ROMA(%)=Exp(PI)x1001+Exp(PI)注：风险指数PI（PredictiveIndex）LN为自然对数内容•罗氏HE4检测原理•Elecsys®HE4SFDA注册研究概况•Elecsys®HE4性能评估•Elecsys®HE4性能小结病例报告患者，女，45岁，B超检查发现卵巢肿块，罗氏试剂电化学发光法检测血清HE4浓度，结果为136pmol/L。如何判断这患者HE4结果是否异常？临床判断HE4检测结果应考虑的问题1.参考值2.HE4实验室检测误差3.样本检测前误差：标本采集影响标本保存的影响干扰物质的影响人生理变异治疗措施的干扰（药物）其他疾病的干扰三组各年龄段HE4浓度比较a均值±标准差pmol/l（例数）；青年组：45岁；中年组：45-59岁；老年组：≧60岁。*LSD检验；#经随机区组设计方差分析组别总计a(323)青年组a(34)中年组a(108)#老年组a(181)#OC组337.5±156.4(160)304.6±143.2(19)334.7±156.4(60)373.3±132.5(81)良性组72.0±38.7(54)*50.6±16.3(10)68.7±12.6(18)96.6±38.7(26)健康组59.2±22.9(109)*42.2±8.9(5)58.7±7.6(30)76.8±5.6(74)1、参考值HE4在不同观察组间的差异OC组，不同年龄的HE4良性病变组，不同年龄的HE4健康对照组组，不同年龄的HE4年龄因素对HE4浓度的影响HE4在各年龄组参考值的设定和诊断价值评估•所有病例的ROC曲线•青年组的ROC曲线AUCCutoff点(PM)敏感性特异性总体0.8398267.3%93.6%青年组0.9467583.4%92.6%HE4在各年龄组参考值的设定和诊断价值评估•中年组的ROC曲线•老年组的ROC曲线AUCCutoff点(PM)敏感性特异性中年组0.870*8075.0%93.1%老年组0.775*13050%93.2%2、实验室检测误差•日间精密度（罗氏）•日间精密度（验证）在三个研究中心进行的重复性检测的结果：不精密度（CV)＜５％低值（44.3）CV=2.1%高值（1317）CV=1.9%2、实验室检测误差初步结论实验室检测误差5%样本检测前误差血清、血浆（EDTA、肝素）样品保存（24h内）血清血浆，血清24h内检测，HE4无显著性差异样本检测前误差干扰物质影响（罗氏）药物的影响（罗氏）回收率均±10%结论：上述浓度下的干扰物质和药物对HE4检测无显著影响。样本检测前误差•对HE4浓度分别在65pmol/L和155pmol/L进行检测，判断与乳清酸性蛋白家族其他成员的交叉反应性•Elafin:弹性蛋白酶特异性抑制剂•SLPI：分泌性白细胞蛋白酶抑制剂•干扰物质的影响：交叉反应（罗氏）结论：交叉反应对HE4结果的影响可忽略不计。样本检测前误差•HE4生理变异的影响（n=2)初步结论:HE4个体日间变异度10%样本检测前误差•肺部疾病的影响•肾功不良的影响结论：肺部疾病，尤其是肾衰显著影响HE4水平总结1、HE4的参考值需按年龄段设定2、HE4实验室检测误差5％2、HE4个体日间变异度约10％3、肺部疾病和肾衰HE4水平显著升高4、其他样品前检测影响因素对HE4的影响不显著5、HE4结果超过参考值上限20％判断为异常，对高于正常参考限但未大于20％的患者，应连续追踪观察。患者HE4结果的初步判断•患者，女，45岁，B超检查发现卵巢肿块，罗氏试剂电化学发光法检测血清HE4浓度，结果为136pmol/L•肾功正常，无肺部疾病•病理诊断：卵巢癌实验室检测误差约136x5％＝6.8个体变异＝36x10%=13.6预计该患者HE4的结果为115.6－156.4范围内该年龄组参考限为80pmol/L结论：该患者HE4异常增高内容•罗氏HE4检测原理•Elecsys®HE4SFDA注册研究概况•Elecsys®HE4性能评估•Elecsys®HE4性能小结Elecsys®HE4性能参数小结Elecsys®HE4性能参数检测时间18min检测原理一步三明治法校准2点定标溯源性HE4EIAfromFujirebioDiagnostics,Inc.样本类型•采用含有分离胶标准样本管采集的血清•肝素锂，K2-EDTA和K3-EDTA抗凝的血浆样本量10µL空白最低限(LoB)5pmol/L检测范围(LoD)15–1500pmol/L总不精密度cobase411analyzer,E2010:2.7–4.3%cobase601/e602modules,E170:2.8–3.4%可重复性cobase411analyzer,E2010:1.3–1.8%cobase601/e602modules,E170:1.5–1.9%Elecsys®HE4来自巴塞罗纳Dr.Molina的评价•„...ElecsysHE4提供准确的方法学检测，并拥有优秀的精密度....“•„...临床表现...显示与其他方法有良好的一致性“•„...HE4是卵巢癌高灵敏度和特异性的优秀标志物“•„...与卵巢癌的分期明确相关“„...结果稳定可靠，操作简单，结果精确...“Elecsys®HE4结论•整个检测范围均呈现优秀的精密度•所需样本量低•血清和血浆均适用•一管血同时检测HE4和CA125两项指标•溯源至HE4EIAFujirebio•临床相关的Cut-off值具有良好的有效性•临床研究数据适用于良性疾病，卵巢癌的监测和风险评估