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出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌检验方法MethodfortheexaminationofListeriamonocytogenesinfoodsforexportSN0184—931主题内容与适用范围本标准规定了食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检验方法。本标准适用于牛乳、乳制品、水产品、肉及肉制品食品。其他食品可参照采用。2原理单核细胞增生李斯特氏菌是一种能引起人畜共患疾病的致病菌。在胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂(TSA—YE)、选择性培养基(MMA)等平板上用450角斜射光照射可观察到蓝色菌落；水解七叶苷并与柠檬酸铁铵反应产生黑色菌落。3设备和材料3.1微生物学实验室常用设备。3.2解剖镜。3.3斜射灯。3.4平面镜。4培养基和试剂4.1培养基4.1.1胰酪胨大豆酵母浸膏肉汤(TSB-YE)(见B1)。4.1.2胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂(TSA-YE)(见B2)。4.1.3增菌培养液(EB)(见B3)。4.1.4选择性培养基(MMA)(见B4)。4.1.5牛津琼脂(OXA)(见B5)。4.1.6改良缓冲蛋白胨水(MBP)(见B6)。4.1.77％羊血琼脂(见B7)。4.1.8糖发酵培养基(见B8)。4.1.9半固体琼脂(见GB4789.28中3.28条)。4.1.10尿素琼脂(见GB4789.28中2.15条)。4.1.11硝酸盐培养基(见GB4789.28中2.17条)。4.1.12MR-VP培养基(见GB4789.28中2.4条)。4.1.13三糖铁琼脂(TSl)(见GB4789.28中3.24条)。4.2试剂4.2.1胰酪蛋白胨(或胰蛋白胨)。4.2.2盐酸吖啶黄素。4.2.3萘啶酮酸。4.2.4复达新。甘氨酸酐。4.2.6氯化锂。4.2.7苯乙醇。4.2.8放线菌酮。4.2.9多粘菌素E。4.2.10头孢双硫唑甲氧。4.2.11磷霉素。4.2.12柠檬酸铁铵。4.2.13七叶苷。4.2.14酚红。4.2.15D—葡萄糖。4.2.16D—甘露醇。4.2.17哥伦比亚琼脂。4.2.18酵母浸膏。4.2.19牛肉浸膏。5检验步骤5.1样品如为冷冻食品，应于2～5℃解冻，且不超过18h；若不能及时检验，应置于-15℃保存。非冷冻的易腐样品应尽可能及时检验，若不能及时检验，应置于4℃冰箱保存，在24h之内检验。5.2前增菌和增菌5.2.1前增菌：巴氏消毒乳、乳制品、冷冻水产品，冻肉及其它加工食品均应进行前增菌。无菌操作称取25g样品，加入装有225mL改良缓冲蛋白胨水(MBP)的均质杯内，高速均质l～2min，制成1：10样品匀液，转入500mL广口瓶内；液体食品可用吸管吸取25mL样品，加入装有225mL改良缓冲蛋白胨水(MBP)的广口瓶内，充分振摇制成1：10样品匀液，于30℃培养18～24h。移取1mL，转种于100mL增菌培养液(EB)内，于30℃培养24、48h，分别进行分离。5.2.2直接增菌：生乳、鲜肉及未经加工处理过的样品不必经过前增菌。检验时，以无菌操作取25g(25mL)样品，按前法所述，用225mL增菌培养液代替改良缓冲蛋白胨水制成1：10样品匀液，于30℃培养24和48h，分别进行分离。5.3分离5.3.1取增菌液一环，划线接种于选择性培养基(MMA或OXA)平板上，于35℃培养24～48h。5.3.2斜射光镜检：将解剖镜、斜射灯、平面镜，如图1所示装置，使光源以45°角照射到平面镜上，再反射为解剖镜光源。将MMA平板放在解剖镜载物台上，通过目镜垂直向下观察，李斯特氏菌菌落在此平板上，呈现蓝色或蓝灰色，扁平圆润，稍有凸起，边缘整齐，菌落较小，约为0.5mm左右。使用解剖镜观察并挑取五个可疑菌落，划线接种到胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂(TSA—YE)平板，于35℃培养18～24h，纯培养后进行鉴定。黑色菌落观察：李斯特氏菌在OXA平板上生长24h后菌落呈黑色，直径为1mm，在其周围形成一个黑色环。培养48h，菌落仍呈黑色，直径2～3mm，除在菌落周围有一环外，在菌落中心部位的深层也形成黑点。挑取五个可疑菌落，接种于TSA—YE平板上，纯培养后进行鉴定。图1斜射光镜检示意图5.4鉴定5.4.1蓝色菌落检验：用45°斜射光镜检TSA—YE平板上的蓝色菌落，如纯化不理想，可再次挑取可疑菌落于TSA—YE平板上培养，直至获得满意结果为止。将纯化后的菌落接种于TSB—YE肉汤，于35℃培养24h，供生化等项目检验使用。5.4.2典型运动镜检：在TSA—YE平板上挑取生长良好的菌落于洁净载玻片上，用0.85％灭菌生理盐水制成悬浮液，压上盖玻片，于显微镜下用油镜观察，李斯特氏菌为短棒状杆菌，可见轻微的旋转及翻滚，这是该菌的典型运动特征。5.4.3过氧化氢酶试验：挑取TSA—YE平板上的菌落于洁净载玻片上，滴加1滴3％的过氧化氢(H202)溶液，李斯特氏菌呈过氧化氢酶阳性反应。5.4.4革兰氏染色：按照常规方法进行革兰氏染色，李斯特氏菌呈革兰氏阳性反应。5.4.5溶血试验：将7％羊血琼脂平板底面划分为20～25个小格，每格刺种一个菌落。从每个TSA—YE平板上至少挑取2个菌落刺种血平板，并刺种阳性对照菌(单核细胞增生李斯特氏菌)和阴性对照菌(英诺克李斯特氏菌)，于35℃培养24—48h。于明亮处进行观察，单核细胞增生李斯特氏菌和西尔李斯特氏菌在刺种点周围产生窄小的透明p型溶血环；绵羊李斯特氏菌有大的透明p型溶血环；其他李斯特氏菌种不产生溶血环。5.4.6尿素酶试验：用TSB—YE肉汤培养物穿刺接种于尿素琼脂斜面上，于35℃培养5d，逐日观察，李斯特氏菌呈尿素酶试验阴性反应，斜面无颜色变化。5.4.7硝酸盐还原试验：用TSB—YE肉汤培养物接种于硝酸盐肉汤中，于35℃培养5d，加入0.2mL试剂A，再加入0.2mL试剂B，轻摇混合。如在1～2min内出现红色，判断为阳性反应；如果没有颜色显现，在含有试剂A和试剂B的试管内再加入少量锌粉(约20mg)，放置1h，如出现红色，表示仍有硝酸盐存在，未被细菌还原，判断为阴性。5.4.8MR—VP试验：将TSB—YE肉汤培养物接种于MR—VP肉汤中，于35℃培养48h。移取1mL培养物于洁净试管中，加5％。—萘酚溶液6mL，再加40％氢氧化钾溶液0.2mL轻轻摇动试管约1min，静置约20min，出现红色为VP阳性反应；将剩余培养液继续于35℃培养2d，加甲基红指示剂5滴于试管中，出现红色为MR阳性反应。李斯特氏菌均为MR—VP阳性反应。5.4.9三糖铁试验：用TSB—YE肉汤培养物接种于三糖铁琼脂(TSl)，于35℃培养5d。李斯特氏菌在斜面和底层产酸，不产硫化氢(H2S)。5.4.10糖发酵试验：将TSB—YE肉汤培养物分别接种于0.5％葡萄糖、麦芽糖、七叶苷、甘露醇、鼠李糖、木糖发酵管内，于35℃培养24～48h，阴性继续培养到第5天，李斯特氏菌不产气，其不同菌种生化反应见表1。5.4.11动力试验：将TSB—YE肉汤培养物垂直中心穿刺于半固体动力培养基，于室温(20～25℃)培养2～5d，逐日观察。李斯特氏菌有动力，在半固体试管内呈典型伞状生长，底部为弯月牙形。5.4.12协同溶血作用试验(cAMP，又称环腺苷酸试验)：在羊血琼脂平板上各划一直线，使两线平行，在两平行线上分别接种β型溶血金黄色葡萄球菌(J.aureus)和马红球菌(R.equi)培养物，在该两线之间垂直划线接种待测菌培养物，与两线相近但不相交，于35℃培养24～48h后，观察相交处溶血情况。单核细胞增生李斯特氏菌(L.monocytogenes)和西尔李斯特氏菌(Lseeligeri)在靠近金黄色葡萄球菌接种点附近的溶血增强，绵羊李斯特氏菌(Livanovii)在靠近马红球菌接种点附近的溶血增强，可见有明显的箭头状溶血现象；其他李斯特氏菌不产生溶血。5.4.13血清学检验：将TSB—YE肉汤培养物接种到3mLTSB—YE肉汤中，于35℃培养24h；接种2支TSA—YE琼脂斜面，于35℃培养24h；用3mL0.01mol/L磷酸盐缓冲液将斜面菌苔洗下，菌悬液于80℃水溶中加热1h，以2500r／min离心30min，弃去2mL上清液，将剩余液与沉淀混匀制成菌悬液，进行血清学玻片凝集试验。5.4.14小鼠毒力试验：将分离的菌株接种到10mLTSB—YE肉汤中，于35℃培养24h，将10mL培养物全部转移到离心管中，以.2500r／min离心30min，弃去上清液，用1mL的0.85％灭菌生理盐水制成菌悬液(此时的浓度约为l010个菌／mL)，腹腔注射体重为16～18g小鼠，每只注射0.1mL，约注入109个菌，每组5只，观察7d内小鼠死亡情况。用已知致病的单核细胞增生李斯特氏菌和非致病的英诺克李斯特氏菌的菌株按同法进行，做对照试验。6报告结果6.1协同溶血作用试验、血清学试验和动物试验可根据需要进行；常规检验可不进行这些试验。检验程序见附录A(补充件)。6.2单核细胞增生李斯特氏菌与其他李斯特氏菌种的鉴别见表1。表1李斯特氏菌菌种鉴别特征中文菌名原名蓝色菌落典型运动过氧化氢酶革兰氏染色溶血试验动力试验尿素酶试验硝酸盐还原MR-VP试验三糖铁试验糖发酵利用小鼠毒力试验葡萄糖麦芽糖七叶苷甘露醇鼠李糖木糖单核细胞增生李斯特氏L.monocylogenes++++++一一+／+产酸，不产H2S+++ + +注：V一反应不一定。表2李斯特氏菌菌种的主要鉴别特征注：Un—未命名；V—反应不一定。6.2.1报告阳性结果：检出单核细胞增生李斯特氏菌。6.2.2报告阴性结果：未检出单核细胞增生李斯特氏菌。菌绵羊李斯特氏菌L.ivanovii++++++——+／+产酸，不产H2S+++——++英诺克李斯特氏菌L.innocua++++ +——+／+产酸，不产H2S+++—V——威尔斯李斯特氏菌L.welshimeri++++ +——+／+产酸，不产H2S+++—V+—西尔李斯特氏菌L.seeligeri++++++——十／+产酸，不产H2S+++——+—格氏李斯特氏菌L.grayi+十十+—十——十／+产酸，不产H2S+++十———默氏李斯特氏菌L.murravi++++—+—++／+产酸，不产H2S++++V——中文菌名原名血清型溶血试验硝酸盐还原糖发酵cAMP试验小鼠毒力试验甘露醇鼠李糖木糖金黄色葡萄球菌马红球菌单核细胞增生李斯特氏菌L.monocytogenes1／2A，1／2B，l／2C3A，3B，3C4A，4AB，4B4C，4D，4E，“7”十——+—+—+绵羊李斯特氏菌L.ivanovii5+———+—++英诺克李斯特氏菌L.innocua4AB，6A，6B，Un———V ———威尔斯李斯特氏菌L.zoelshimeri5A，6B———V+———西尔李斯特氏菌L.seeligeri1／2B，4C，4D，6B，Un+———十+——格氏李斯特氏菌L.grayi ——+—————默氏李斯特氏菌L.murravi —++V————附录B培养基的制备(补充件)B1胰酪胨大豆酵母浸膏肉汤(TSB—YE)将各成分加热煮沸溶解冷却后，调整至pH7.3±0.2，分装于三角瓶中，每瓶225mL，于121℃高压灭菌15min。B2胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂(TSA—YE)除琼脂外，将其他各成分加热煮沸溶解，冷却后调整至pH7.3±0.2，再加入琼脂，于121℃高压灭菌15min，供制备平板和斜面使用。B3增菌培养液(EB)B3.1盐酸吖啶黄溶液振摇混匀，充分溶解后过滤除菌。B3.2萘啶酮酸溶液振摇混匀，充分溶解后过滤除菌。B3.30.05mol／L氢氧化钠溶液胰酪蛋白胨(或胰蛋白胨)17.0g植物(大豆)蛋白胨3.0g氯化钠5.0g磷酸氢二钾2.5g葡萄糖2.5g酵母浸膏6.0g蒸馏水1000mL胰酪蛋白胨(或胰蛋白胨)15.5g植物蛋白胨5.0g氯化钠5.0