细胞因子技术方法

细胞因子及检测方法细胞因子是一类由免疫细胞和某些基质细胞分泌的低分子量糖蛋白。它参与调节机体免疫反应、生血造血功能、细胞与细胞间的交流以及宿主对感染、炎症的反应等。研究细胞因子有助于阐明分子水平的免疫调节机制，有助于疾病的预防、诊断和治疗,具有非常广阔的应用前景。细胞因子概述白细胞介素(interleukin,IL)集落刺激因子(colonystimulatingfactor,CSF)干扰素(interferon,IFN)肿瘤坏死因子（tumornecrosisfactor,TNF）淋巴因子（lymphokine）单核因子（monokine）细胞因子分类细胞因子的结构IL-8不同细胞因子之间在结构上有很大差异，多数细胞因子为小分子多肽，分子量不超过60KD，多由100个左右的氨基酸组成。不同细胞因子之间无明显的氨基酸序列同源性。多数细胞因子以单体形式存在，少数因子如IL-5、IL-12、M-CSF、TGF-β等以双体形式存在。绝大多数因子带有糖基，糖基多与细胞因子的生物活性无关，可能起延长细胞因子体内半衰期的作用。ELISA方法ELISpot方法胞内染色流式检测方法可溶性蛋白流式高通量检测Luminex技术细胞因子的免疫学检测酶联免疫吸附实验（ELISA，Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay-)细胞因子ELISA检测夹心ELISA（SandwichELISA）：定量检测标本中的目的抗原。其优点是避免了对特异性抗体的直接标记，但增加了操作步骤和测定时间。间接ELISA（IndirectELISA）：用于筛检抗体（抗特定抗原成分的特异性抗体）。此法是测定抗体最常用的方法竞争ELISA（CompetitiveELISA）：用于确定抗原特异性或待检标本中含交叉反应成分时为了提高实验的特异性而使用的一种方法。根据标记抗原与同种未标记待测抗原与抗体间发生竞争性结合的原理，主要用于测定小分子抗原。第1步，包被捕获抗体到96孔板中，BSA阻断后加入标准品或者标本第2步，加入酶标的抗体，结合被捕获的细胞因子第3步，加入酶的底物显色，酶标仪或者化学发光议读取结果第4步，绘制标准曲线，计算标本中细胞因子的含量技术优势检测细胞因子的传统方法操作较简便，无需昂贵的仪器设备可供选择的品种齐全结果可靠灵敏度较高酶联免疫斑点法ELISpot(Enzyme-LinkedImmunosorbentpot)第1步将待测细胞加入已包被捕获抗体的孔中，根据检测指标确定具体的孵育时间第一天第2步洗去细胞，分泌的细胞因子被抗体捕获第3步加入生物素化特异性检测抗体第二天操作流程第4步加入碱性磷酸酶－链亲和素第5步加入底物，形成斑点第6步斑点计数，数据分析第三天IFN-gELISpot试剂盒分析人PBMC结果人PBMCs使用calciumionomycin和PMA刺激过夜后使用IFN-gELISpot试剂盒（目录号EL285）分析的结果细胞刺激后结果未刺激细胞对照实验结果ELlSpot技术优势可在单细胞水平检测淋巴细胞对特异性抗原的反应能力计数特异性抗原刺激下分泌性淋巴细胞产生的比例有效、快速、灵敏度高使用高吸附性的ELISPOT培养板，淋巴细胞分泌的细胞因子直接与培养板上吸附的包被抗体相结合细胞因子的检测不易受非分泌细胞的干扰比传统的ELISA和细胞内细胞因子染色法敏感20-200倍易操作样本量大的情况下实验结果可用计算机图象分析系统进行快速、客观的分析应用领域B细胞杂交瘤的筛选化合物和药物免疫学反应的检测优化树突细胞和T细胞的抗肿瘤活性靶向疫苗的质控自身免疫疾病的诊断和预后分析自身免疫疾病免疫治疗的监控过敏性疾病的脱敏治疗的监测器官移植中排斥反应的预测微量组织、肿瘤和免疫细胞分泌谱的分析结核病的诊断细胞内染色流式检测法细胞内染色流式分析法是用细胞经刺激活化后分泌细胞因子，用特异性抗体与细胞内特定细胞因子标志结合，即可检测不同细胞亚群细胞因子的分泌。胞内染色操作步骤细胞表面抗原染色刺激细胞（PMA、Ionomycin、BFA）固定、破膜细胞因子染色快速：流式定量检测细胞内细胞因子可在一天内完成，实验流程需6-8小时，实际操作时间为1-2小时，快速简便；简便：无需组织培养，可以全血分析，无需分离PBMCs；灵敏度高：高度灵敏的荧光标记与检测系统；高效：可以在同一个细胞内同时检测两种或更多种细胞因子，也可根据细胞免疫表型区分分泌细胞因子的细胞的亚型，进行多参数相关分析；安全：减少样本处理与生物源性污染接近生物体的分析条件：全血检测保留细胞及生化微环境更准确反映了体内状况。技术优势所需试剂细胞表面染色抗体固定液、破膜剂细胞因子抗体刺激剂可溶性蛋白流式高通量检测法（FlowCytomix技术）操作流程细胞因子与微球上包被的捕获抗体结合荧光素标记抗体与上述抗原-抗体复合物结合形成抗体-抗原-抗体夹心复合物细胞因子与疾病技术优势高通量：可使用96孔板，每个标本可同时检测多达10个指标可自由组合检测指标，更灵活操作简单，节约成本所需标本量少：25ul适用标本范围广灵敏度高，检测范围宽IL-2IL-4TNFaGmCSFLuminex检测原理技术优势多元分析，可以节约试剂、时间和精力。所需标本量少，尤其适合于分析稀有样本开放性实验平台，即Luminex仪器可用于免疫分析、核酸研究、酶学分析、受体和配体识别分析等研究参与感染引起的炎症反应如:TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等细胞子。促进肿瘤细胞生长和转移如：TGF-β、IL-10、IL-6等细胞因子。介导移植排斥反应如：IL-2、IFN-γ等细胞因子。介导免疫性疾病(1)免疫缺陷如：IL-2受体γ链基因(X染色体)突变IL-2、IL-4、IL-7、IL-9及IL-15等细胞因子功能障碍。(2)超敏反应如：IL-4、IFN-γ等细胞因子。(3)自身免疫性疾病如：IFN-γ、IL-2等细胞因子。细胞因子与疾病的发生诊断---缺少特异性IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ等缺失---T细胞活化及功能缺陷TNF-α（血清）↑---类风湿关节炎、感染性休克等IL-1、IL-6及TNF-α（关节囊滑液）↑---类风湿关节炎IL-1（血清）↑---慢性血清病、免疫复合物肾病等sIL-2R（血清）↑---白血病、多发性硬化、AIDS、移植排斥反应等治疗治疗方式：A.细胞因子补充疗法B.细胞因子阻断疗法（1）治疗炎症反应IFN-α：疱疹性角膜炎、乙型肝炎等IL-10：类风湿性关节炎细胞因子与疾病的诊断及治疗（2）治疗恶性肿瘤IL-2：肾细胞癌、黑色素瘤IL-1～8、IL-10、IL-12、G-CSF、IFN-α、IFN-γ、TNF-α等(转基因)：多种肿瘤。（3）治疗自身免疫性疾病IFN-β：多发性硬化症（MS）IFN-γ、IL-1的抑制剂和TNF-α的McAb：类风湿性关节炎(RA）抗IL-6McAb：SLE（4）治疗移植排斥IL-2、IL-3、IL-6、GM-CSF等：骨髓移植抗IL-2受体γ链McAb：移植排斥（5）治疗造血系统疾病CSFs：造血功能异常EPO：肾性贫血M-CSF：白细胞减少部分用于临床的细胞因子EPO:恶性肿瘤或化疗导致的贫血、慢性肾功衰竭导致的贫血、失血后贫血。G-CSF:化疗导致的粒细胞减少症、自身骨髓移植、白血病、再生障碍性贫血、AIDS。GM-CSF:化疗导致的血细胞减少症、自身骨髓移植、再生障碍性贫血、AIDS、MDS。IFN-α:恶性肿瘤、白血病、肝炎、AIDS、Kaposi肉瘤IFN-β:多发性硬化症IFN-γ:恶性肿瘤、类风湿关节炎、感染性疾病、慢性肉芽肿过敏性皮炎、生殖器疣IL-2:恶性肿瘤、免疫缺陷、疫苗佐剂IL-11:恶性肿瘤、化疗导致的血小板减少症sTNFR-I:类风湿关节炎