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4.磷酸酶测定(磷酸苯二钠比色法)：1、试剂配制（1）甲苯（2）磷酸笨二钠：称取6.75g磷酸笨二钠（C6H5PO4Na2.2H2O）溶于水，并稀释至1L（1毫升含25mg酚）（3）缓冲液（4）pＨ9.0硼酸盐缓冲液：硼酸盐缓冲液（pH9.0）A：0.05M硼砂溶液：19.07g硼砂（Na2B4O710H2O）溶于1000mL蒸馏水中B：0.2M硼酸溶液：12.37g硼酸（H3BO3）溶于1000mL蒸馏水中硼酸盐缓冲液（pH9.0）：80mLA+20mLB混匀即得缓冲溶液配制：(1)酸性磷酸酶:醋酸盐缓冲液(pH=5.0)A：0.2M醋酸钠溶液：16.4g无水醋酸钠（C2H3O2Na）溶于1000mL蒸馏水中，或是27.2g三水醋酸钠（C2H3O2Na.3H2O）溶于1000mL水中。B：0.2M醋酸溶液：11.55mL醋酸定容于1000mL醋酸盐缓冲液(pH=5.0)：7mLA＋3mLB混合即得（2）碱性磷酸酶：硼酸盐缓冲液（pH10.0）硼砂－氢氧化钠缓冲液（pH10.0）：A：硼砂液：19.072g硼砂溶于1000mL蒸馏水中B：氢氧化钠溶液：4g氢氧化钠溶于1000mL蒸馏水中50mLA＋43mLB加水稀释至200mL，混匀即得（4）中性磷酸酶：柠檬酸盐缓冲液（pH7.0）A：0.1M柠檬酸溶液：21.01g柠檬酸.H2O（或是19.21gC6H8O7）溶于1000mL蒸馏水中B：0.2M磷酸氢二钠：35.61g磷酸氢二钠.2H2O（53.63g磷酸氢二钠.7H2O或是71.7g磷酸氢二钠.12H2O）溶于1000mL蒸馏水中柠檬酸盐缓冲液（pH7.0）：3.63mLA+16.37mLB混匀即得（5）2.5％铁氰化钾（6）0.5％的4－氨基安替吡啉溶液（7）酚原液：2克酚溶液蒸馏水定容致1升（2mg/mL），溶液在暗色中稳定。（8）酚工作液：取2.5mL原液稀释至100mL（0.05mg酚/mL）2、操作步骤：称取5ｇ土于50mL容量瓶中，加1mL甲苯，加塞塞紧轻摇15min。再加入5mL磷酸苯二钠（6.75g溶于1L水）和5mL相应的缓冲液(酸性磷酸酶用pＨ5.0大醋酸缓冲液，中性磷酸酶用pH7.0的柠檬酸缓冲液，碱性磷酸酶用pH10的硼酸缓冲液)，同时对每一土样都设置用5mL水代替基质的对照。仔细摇匀后放入恒温箱,在37℃下培养24ｈ。用热至38℃的蒸馏水将容量瓶中混合物稀释至刻度(甲苯浮在刻度以上)，再用致密滤纸过滤。取1mL滤液于100mL容量瓶中，加5mLpＨ9.0硼酸盐缓冲液，再加入3mL2.5％的铁氰化钾和3mL0.5％的4－氨基安替吡啉溶液，摇动，仔细混匀，这时溶液呈粉红色，然后加水定容。待颜色稳定时（20-30min），在波长570nm处测定各样品的消光值。土壤的磷酸酶活性根据标准曲线求出酚的含量。磷酸酶活性以每克土壤的酚毫克数表示（若用P的毫克数表示，结果需乘0.32；若用P2O5的毫克数表示，需乘2.29）。标准曲线：分别向100mL容量瓶中注入1，3，5，7，9，11mL工作液并显色定容（分别相当于0.05，0.15，0.25，0.35，0.45，0.55mg酚），待颜色稳定后，比色绘制标准曲线。