丙二醛含量测定

实验六、植物组织丙二醛含量测定实验六、植物组织丙二醛含量测定植物叶片在衰老过程中发生一系列生理生化变化，如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低及内源激素平衡失调等。这些指标在一定程度上反映衰老过程的变化。近来大量研究表明，植物在逆境胁迫或衰老过程中，细胞内活性氧代谢的平衡被破坏而有利于活性氧的积累。活性氧积累的危害之一是引发或加剧膜脂过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤，严重时会导致植物细胞死亡。活性氧包括含氧自由基。自由基是具有未配对价电子的原子或原子团。生物体内产生的活性氧主要有超氧自由基(O-2)、羟自由基(OH·)、过氧自由基(ROO·)、烷氧自由基(RO·)、过氧化氢（H2O2）、单线态氧（O21）等。植物对活性氧产生有酶促和非酶促两类防御系统，超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶POD和抗坏血酸过氧化物酶(ASA—POD)等是酶促防御系统的重要保护酶，抗坏血酸(ASA)和还原型谷胱甘肽(GSH)等是非酶促防御系统中的重要抗氧化剂。丙二醛(MDA)是细胞膜脂过氧化作用的产物之一，它的产生还能加剧膜的损伤。因此，丙二醛产生数量的多少能够代表膜脂过氧化的程度，也可间接反映植物组织的抗氧化能力的强弱。所以在植物衰老生理和抗性生理研究中，丙二醛含量是一个常用指标。[原理]植物组织中的丙二醛(MDA)在酸性条件下加热可与硫代巴比妥酸(TBA)产生显色反应，反应产物为粉红色的3，5，5一三甲基恶唑2，4一二酮(Trimet—nine)。该物质在539nm波长下有吸收峰。由于硫代巴比妥酸也可与其它物质反应，并在该波长处有吸收，为消除硫代巴比妥酸与其它物质反应的影响，在丙二醛含量测定时，同时测定600nm下的吸光度，利用539nm与600nm下的吸光度的差值计算丙二醛的含量。[材料、仪器、药品]1．材料：植物抗逆性鉴定实验中的四种菠菜样品，即绿色和黄色叶片的高温处理和室温对照。2．仪器：(1)分光光度计；(2)离心机；（3）水浴锅：(4)天平；(5)研钵；(6)剪刀；(7)5ml刻度离心管；(9)刻度试管(10ml)；(10)镊子；(11)移液管(5ml、2ml、1ml)；（12）冰箱。3．药品：(1)0.05mol/LpH7.8磷酸钠缓冲液；(2)石英砂；(3)5％三氯乙酸溶液：称取5g三氯乙酸，先用少量蒸馏水溶解，然后定容到100ml；(4)0.5％硫代巴比妥酸溶液：称取0.5g硫代巴比妥酸，用5％三氯乙酸溶解，定容至100ml，即为0.5％硫代巴比妥酸的5％三氯乙酸溶液。[方法]1．丙二醛的提取：取0.5g样品，加入2ml预冷的0.05mol/LpH7.8的磷酸缓冲液，加入少量石英砂，在经过冰浴的研钵内研磨成匀浆，转移到5ml刻度离心试管，将研钵用缓冲液洗净，清洗也移入离心管中，最后用缓冲液定容至5ml。在4500转/min离心10min。上清液即为丙二醛提取液。2．丙二醛含量测定：吸取2ml的提取液于刻度试管中，加入0.5％硫代巴比妥酸的5%三氯乙酸溶液3ml，于沸水浴上加热10min，迅速冷却。于4500转/min离心10min。取上清液于532、600nm波长下，以蒸馏水为空白调透光率100%，测定吸光度。3．结果计算：(A532—A600)×V1×V1.55×10-1×W×V2丙二醛含量（nmol/g）=式中：A为吸光度；V1为反应液总量(5m1)；V为提取液总量(5ml)；V2为反应液中的提取液数量(2ml)；W为植物样品重量(0.5g)；1.55×10-1为丙二醛的微摩尔吸光系数（在1升溶液中含有1µmol丙二醛时的吸光度）。4．注意事项：(1)0.1~0.5％的三氯乙酸对MDA—TBA反应较合适，若高于此浓度，其反应液的非专一性吸收偏高；(2)MDA—TBA显色反应的加热时间，最好控制沸水浴10~15min之间。时间太短或太长均会引起532nm下的光吸收值下降；(3)如用MDA作为植物衰老指标，首先应检验被测试材料提取液是否能与TBA反应形成532nm处的吸收峰。否则只测定532、600nm两处A值，计算结果与实际情况不符，测得的高A值是一个假象；(4)在有糖类物质干扰条件下(如深度衰老时)，吸光度的增大，不再是由于脂质过氧化产物MDA含量的升高，而是水溶性碳水化合物的增加，由此改变了提取液成分，不能再用532nm、600nm两处A值计算MDA含量，可测定510、532、560nm处的A值，用A532一(A510—A560)/2的值来代表丙二醛与TBA反应液的吸光值。[实验结果记录]1．实验材料：植物名称：种植地点：发育时期：试验处理：植物的生长状况：取样时间差：取样部位和数量：2．测定地点：3．测定时间：年月日时分至时分4．测定条件记录5．实验数据记录：样品处理重复A532A600丙二醛含量（nmol/gFW）绿叶高温处理123平均标准差室温对照123平均标准差黄叶高温处理123平均标准差室温对照123平均标准差[实验前思考题]（1）通过丙二醛含量测定能够解决什么理论和实际问题？（2）什么时候植物会发生严重的膜脂过氧化作用？简述其过氧化作用过程。（3）说明膜脂过氧化作用的对植物的效应。（4）TBA为什么要溶解在三氯乙酸中？（5）提取液与TBA的混合液为什么要加热？为什么加热时间又不能过长？（6）为什么要测定反应液在600nm下的吸光度？（7）在计算公式中，为什么吸光系数的单位是微摩尔，而最后的含量单位却是毫微摩尔？（8）写出实验时间按排和操作流程图。（9）写出抗逆性鉴定和丙二醛含量测定实验统一的时间按排和操作流程图。[实验后思考题]（1）如果可溶性糖含量影响丙二醛含量的测定，你有什么办法消除其影响？（2）丙二醛反应液为什么加热时间过长会影响测定结果？