第五章-核磁共振方法解析蛋白质结构

核磁共振方法解析蛋白质结构核磁共振是解析蛋白质结构的一种重要方法•优点：不需结晶；可研究动力学。•缺点：受分子量限制，需要标记。MalatesynthaseG(82kDa)RichardRobertErnst•ErnstwasawardedtheNobelPrizeinChemistryin1991forhiscontributionstowardsthedevelopmentofFourierTransformnuclearmagneticresonancespectroscopyandthesubsequentdevelopmentofmulti-dimensionalNMRtechniques.KurtWüthrich•HewasawardedhalfoftheNobelPrizeinChemistryin2002forhisdevelopmentofnuclearmagneticresonancespectroscopyfordeterminingthethree-dimensionalstructureofbiologicalmacromoleculesinsolution.核磁共振的原理•自旋量子数（I）原子序数和原子质量都为偶数：I=0(12C,16O)原子序数为奇数，原子质量为偶数：I=整数(14N,2H,10B)原子质量为奇数：I=半整数(1H,13C,15N,31P)•自旋状态（M）M=I,(I-1),(I-2),…,-I对于1H,13C,15N,31P来说:M=1/2,-1/2•凡自旋不为零的原子核，在外加静磁场中发生能级裂分，共振吸收一特定频率的射频电磁场能量的现象，即为核磁共振。Bo=0Bo0ΔE=γhBo/2π=hυabγ为磁旋比，由核的性质所决定。•核磁共振的灵敏度Nα-NβNα/Nβ=eΔE/kTΔE=γhBo/2π对于在400MHz(Bo=9.5T)磁场下的1H：Nα/Nβ=1.000064•磁场越强，灵敏度越高•磁旋比越大，灵敏度越高γ1H=26.75rad/G；γ13C=6.73rad/G；γ15N=-2.71rad/G•核的丰度越高，灵敏度越高•1H谱天然丰度高；灵敏度高。•13C谱天然丰度低；灵敏度低；化学位移拓展宽、分辨率好•15N谱天然丰度低；灵敏度低；化学位移拓展宽、分辨率好•核磁共振的频率ΔE=γhBo/2πυ=γBo/2πΔE=hυ在常用磁体（2.35-18.6T）下，1H的共振频率在100-800MHz范围，13C为它的1/4，15N为它的1/10。10-1010-810-610-410-2100102wavelength(cm)g-raysx-raysUVVISIRm-waveradio•进动(larmor)频率ω=2πνω0=γB0核磁共振的主要参数•化学位移•耦合常数•峰强•核欧佛豪斯效应（NOE）•横向驰豫时间•纵向驰豫时间•线宽化学位移•不同的原子处于不同的化学环境，即处于不同的电磁环境,因此表现出不同的共振频率：υ=γ（Bo±B）/2πω=2πυ=γ(Bo±B)•逆磁屏蔽•微磁环境•Beff=B0-Bloc---Beff=B0(1-σ)•化学位移的表示方法H3CSiCH3CH3CH3AromaticIminesAmidesHCb,g,d,...HCawater109876543210•影响化学位移的效应：1.环流位移效应环状分子的大π电子云产生的附加磁场对核的影响2.顺磁离子效应金属离子对周围核的影响3.pH滴定效应不同pH下各基团解离情况的不同对化学位移的影响耦合常数•自旋耦合共价键（1-4个键）相连核之间的特性张量的相互作用13C1H1H1Hone-bondthree-bond•自旋裂分由于被测核与相邻核自旋耦合引起的谱线裂分，裂分的大小称为耦合常数aaabbabbISSSIIJ(Hz)•耦合常数不随磁场的变化而变化•两核耦合引起对方谱线裂分的大小相等•相距越远、所隔键数越多，耦合越弱•重原子比轻原子耦合强•耦合常数的大小与耦合核的二面角有关峰强、驰豫和线宽•峰强与共振粒子数成正比。•纵向驰豫是高能原子核将其多余能量交给周围介质而返回低能态的过程。•横向驰豫是由于磁场不均等因素引起的磁化矢量的相移。•由于磁场的不均一，会导致谱线增宽。线宽为横向驰豫时间的倒数。分子翻滚速率、溶液粘度和分子内部运动性等影响线宽。纵向驰豫（T1）横向驰豫（T2）NOE•不同核之间通过空间的偶极相互作用，其强度与核间距的六次方成反比。•若用射频照射核A，其谱峰被抑制，与其空间靠近的另一核B的谱峰会略有增强，其增强的程度，即为NOE强弱的度量。•因NOE的强度与核间距有关，所以是分子结构中的最重要参数。一维谱•共振峰强度随频率（化学位移）变化二维谱•吸收峰强度对两个频率变量作图COSYTOCSYNOESY1H共振的分布异核二维谱多维谱多维NMR解析蛋白质结构谱峰认证自旋体系认证序列认证NOE认证TOCSYNOESYLeuAlaAsnGlyNHHCLeuAlaAsnGlyNHHC用于NMR结构计算的约束•NOE—5Å•化学位移—二级结构•偶极常数—二面角•氢氘交换—氢键•顺磁驰豫增强(PRE)—远距离（30Å）•残余偶极耦合(RDC)—空间定向特征NOE与二级结构化学位移与二级结构偶极耦合与二面角氢氘交换与结构和氢键4.04.0(Has)4.08.0(NHs)7.0t=0-NoD2OAddD2Ot=t1t=t2由核磁数据构建蛋白质溶液三维结构StrongNOE1.8-2.7ÅMediumNOE1.8-3.3ÅWeakNOE1.8-5.0Å3JNa5Hz-80f403JNa8Hz-160f-80核磁共振谱仪的组成•Magnet•Probe•Console•Computer对磁体的要求•高磁场强度•高稳定性•高均匀性高磁场强度：高分辨率高灵敏度•信噪比的完全方程550600650Hz750800850900950Hz11001150120012501300135014001450Hz900MHz600MHz400MHzCurrentDataParametersNAMEtxioestradiolEXPNO3PROCNO1F2-AcquisitionParametersDate_20010126Time16.50INSTRUMspectPROBHD5mmTXI13CZPULPROGzgTD65536SOLVENTCDCl3NS4DS0SWH7440.476HzFIDRES0.113533HzAQ4.4040694secRG180DW67.200usecDE6.00usecTE300.0KD13.00000000sec========CHANNELf1========NUC11HP110.00usecPL1-4.00dBSFO1900.0236581MHzF2-ProcessingparametersSI65536SF900.0200000MHzWDWGMSSB0LB-0.30HzGB0.3PC4.00Oestradiol-acetate样品的准备溶剂的选择1.样品在其中有高溶解度；2.在我们所感兴趣的波谱范围内没有溶剂峰；3.在做变温实验的温度范围内保持液体状态。通常使用一些氘代溶剂•减少溶剂峰的干扰•采用氘核内锁稳定磁场，起锁场的作用•H2O是生物分子最适宜的溶剂(90%H2O,10%D2O)•蛋白质NMR研究的溶液条件pH不要大于7。缓冲体系要保证蛋白质的稳定及高溶解度。蛋白质的浓度通常要求有数mM。避免缓冲液中其他成份对蛋白质谱图的干扰。无机盐浓度不宜大于数百mM。在样品溶液中不能有重金属离子污染。通常加入1mM左右NaN3以避免样品长霉菌。思考题•一个原子在500MHz谱上的化学位移是8ppm，它在800MHz的谱上的化学位移是多少Hz?•一个共振峰在500MHz谱上的耦合常数是10Hz，它在800MHz谱上的耦合常数是多少ppm？•样品浓度增加一倍，场强增加一倍，信噪比各增加多少？为什么？