基因编辑技术

CELLECTISS.A.NASDAQ2015.11.18DNA剪切技术治疗1岁女童获成功基因组编辑技术简介GenomeEditing2015.11.22HuangCH@J208修改遗传信息的第一步：按我们的设计来重组DNA第一节基本概念重组DNA技术：是指在基因水平上，将目的DNA在体外重组于能自我复制的载体DNA分子上，然后将重组DNA导入宿主细胞中进行增生，以获得大量的目的DNA片段，或以此为基础，通过基因的诱导表达，得到大量相应蛋白质产物的过程。又称为分子克隆技术或基因工程技术第二节重组DNA技术的发展史基因工程的诞生1、Berg的开创性实验－第一个实现DNA重组1980年Nobel化学奖猴病毒SV40的DNA+λ噬菌体的DNA2、Boyer-Cohen实验－第一个取得基因工程成功1973年构建双重抗药性重组质粒1973年是基因工程诞生的元年第三节工具酶WernerArber理论预见限制酶HamiltonO.Smith得到第一个限制酶DanielNathans用限制酶切得SV40DNA片断1978年Nobel生理或医学奖1、“基因剪刀”－限制性核酸内切酶1.定义：能识别双链DNA分子中某特定的核苷酸序列，并在识别序列内或附近切割DNA双链结构的一类核酸内切酶（在核酸分子链的内部制造切口的酶）。2.来源：原核生物Ⅰ型酶、Ⅲ型酶：具有限制切割与甲基化修饰活性。Ⅰ型和Ⅲ型酶都没有多大的实用价值。Ⅱ型酶：应用广泛，能在DNA分子内部的特异位点，识别和切割双链DNA，其切割位点的序列可知、固定。通常所说的限制性内切酶就是指Ⅱ型酶。3.分类：根据结构、作用特点不同，分为三类。识别位点：即为Ⅱ型酶识别的特殊DNA序列。通常是4～8个碱基对、具有回文序列的DNA片段5’–GAATTC-3’3’–CTTAAG-5’4.识别和切割位点：①5`突出粘性末端②3`突出粘性末端③平头（钝性末端）5ˊ突出黏性末端(EcoRⅠ)：3ˊ突出黏性末端(PstⅠ)：平端缺口（钝性末端）(SmaⅠ）5ˊ-G↓AATTC-3ˊ5ˊ-GAATTC-3ˊ3ˊ-CTTAA↑G-5ˊ3ˊ-CTTAAG-5ˊ+5ˊ-CTGCA↓G-3ˊ5ˊ-CTGCAG-3ˊ3ˊ-G↑ACGTC-5ˊ3ˊ-GACGTC-5ˊ+5ˊ-CCC↓GGG-3ˊ5ˊ-CCCGGG-3ˊ3ˊ-GGG↑CCC-5ˊ3ˊ-GGGCCC-5ˊ+切割方式：对dsDNA2条链同时切割产生3种不同缺口2、DNA连接酶催化DNA中相邻的5ˊ端磷酸基和3ˊ-OH末端之间形成3ˊ→5ˊ磷酸二酯键。大肠杆菌连接酶，只能连接粘性末端，T4噬菌体连接酶不但能连接粘性末端，还能连接齐平末端。ACG-OHP-AATTCGTTACTTAA-POH-GCA-ACGAATTCGT--TGCTTAAGCA3、DNA聚合酶具有5`→3`聚合活性、5`→3`外切酶活性、3`→5`外切酶活性。可用于合成双链cDNA分子或片断连接，探针制备，序列分析等。耐热DNA聚合酶最适反应温度为75～80℃具有5ˊ→3ˊ外切酶活性，不具有3ˊ→5ˊ外切酶活性（1）5’端标记（2）制备载体时，用碱性磷酸酶处理后，可防止载体自身连接，提高重组效率。碱性磷酸酶有细菌碱性磷酸酶（BAP）和牛小肠碱性磷酸酶（CIP）。CIP能在1%SDS溶液中68℃加热15min而失活，故CIP较为常用。4、碱性磷酸酶去除DNA、RNA、dNTP和NTP5ˊ端的磷酸根。催化单脱氧核苷酸转移到DNA3`-端羟基上。应用：探针标记，标记测序以及制备人工黏性末端。催化多聚核苷酸5ˊ羟基末端磷酸化。用途：⑴放射性标记DNA的5`端⑵使缺少5`-磷酸基的DNA磷酸化用于连接反应。单链核酸内切酶，降解单链DNA或RNA。6、T4多聚核苷酸激酶7、S1核酸酶5、末端转移酶第四节重组DNA技术常用载体是指能携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的一类DNA分子。一、定义分类：克隆载体：用于在宿主细胞中克隆和扩增外源DNA片段。表达载体：用于在宿主细胞中获得外源基因表达产物。1、具备复制能力。2、具备一个或多个筛选标志。3、具备较多拷贝数，易从宿主细胞中分离纯化。4、具备一个或多个限制性内切酶的单一识别点（多克隆位点，MCS）。5、具有较高的遗传稳定性。二、特点这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能：如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。3、常用载体质粒DNA、噬菌体DNA、病毒DNA、酵母DNA1、质粒（plasmid）:质粒为细菌染色体之外一些能独立复制并保持稳定遗传的复制子。结构上，它是一种双链闭合环状的DNA分子。pBR322质粒载体①相对分子质量小，长度为4.3kb。②含有氨苄青霉素和四环素的抗性基因(Ampr和Tetr)。③有24种限制性内切酶位点。④有一个复制起始点（ori）及与DNA复制有关的序列，赋予该质粒复制子特性。⑤为松弛型复制子。是感染细菌的一类病毒，寄生于细菌中，并能溶解细菌细胞，故称噬菌体。2、噬菌体（bacteriophage,phage)噬菌体生活周期4、病毒3、酵母酵母人工染色体（YAC）：用于大片段DNA的克隆。第五节重组DNA技术基本步骤目的基因的获取重组DNA导入受体菌目的基因与载体连接成重组DNA克隆载体的选择重组体的筛选克隆基因的表达↓↓↓↓↓1、制备目的基因（1）化学合成：已知目的基因的核苷酸序列或根据基因产物的氨基酸序列推导出相应基因DNA碱基序列。目前使用DNA合成仪合成的片段长度有限，一般用于小分子活性多肽基因的合成，较长的链则须分段合成，然后用连接酶加以连接。（2）构建基因组DNA文库：将某种生物细胞的整个基因组DNA用物理或酶学的方法切割成预期大小的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因文库。(3)构建cDNA文库：(5)直接用限制性内切酶切取、分离：对一些物理图谱已经确定，背景资料清楚的原核生物、噬菌体及病毒等基因组，可直接用限制性内切酶消化后，通过分离获得目的基因。(4)聚合酶链反应（PCR）已知目的基因的基因序列，用PCR从基因组DNA中获得目的基因，或用逆转录PCR方法直接从mRNA获得特定基因的cDNA。2、克隆载体的选择和构建用于基因组文库构建的载体通常选装载量较大的λ噬菌体和黏性质粒；cDNA文库和克隆较小DNA片段通常选pUC系列质粒；待测DNA序列使用M13噬菌体。由同一种限制酶切割或不同的限制酶切割形成互补的黏性末端。经退火后，由DNA连接酶连接。3、目的基因与载体的连接⑴粘性末端连接：平端DNA片段可以在T4DNA连接酶的作用下相连接，但连接效率较低。为提高连接效率,所用的ATP及T4DNA连接酶的浓度比粘性末端连接要高些。（2）平端连接：（3）定向连接：GAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGAEcoRⅠ切割位点GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTABglⅡ切割位点AATTCGATCTAGAATTCGGATCTAAATTCGATCTAG+EcoRⅠ+BglⅡ双酶切EcoRⅠ+BglⅡ双酶切GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAT4DNA连接酶重组体（4）同聚物加尾连接：（5）人工接头连接：接头是指含有某些限制性内切酶切点的寡核苷酸片段。CCGAATTCGGGCTTAAGC5´-3´-EcoRⅠ4、重组DNA导入受菌体将重组DNA或其他外源DNA导入宿主细胞的常用方法：转化、感染、转染、显微注射、电穿孔等。转化（transformation）：是指将重组质粒DNA导入受体细胞。转染（transfection）：将重组噬菌体DNA直接引入受体细胞的过程。转导（transduction）：重组噬菌体DNA分子，在体外经过包装成具有感染能力的噬菌体颗粒，再以此噬菌体为载体，将重组DNA导入受体细胞内的过程，也称为感染（infection）。5、重组体的筛选与鉴定筛选是指通过某些特定方法，从被转化的细胞群体或基因文库中，鉴别出真正的阳性重组子的过程。（一）根据遗传表型进行筛选的方法（1）抗生素抗性筛选（2）β-半乳糖苷酶系统筛选（二）根据重组子结构特征进行筛选的方法方法：（1）抗生素抗性筛选:大多数载体均带有抗生素抗性基因（一）根据遗传表型进行筛选的方法b.插入失活法:外源基因插入到一个抗性基因位点，使此种抗生素抗性消失，重组体转化的细菌不能在含有这种抗生素的培养基中生长。a.构建重组体时，保留了抗性基因活性，所转化的细胞就能在含此种抗生素的培养基中生长,未转化的细胞则不能生长。(插入失活法)抗生素抗性筛选（2）β-半乳糖苷酶系统筛选（二）根据重组子结构特征进行筛选的方法（1）快速裂解菌落并鉴定分子大小（2）内切酶酶切图谱鉴定（3）分子杂交（4）PCR（5）核酸序列测定（1）分离：提取和获得目的基因和载体（2）切割：分别对目的基因和载体DNA酶切；（3）连接：目的基因与载体连接，形成新的重组DNA分子；（4）转化：用重组DNA分子转化受体细胞；（5）筛选：筛选转化成功的细胞克隆（6）表达：培养获得外源基因的细胞或生物体，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。小结：修改遗传信息的第二步：怎样将需要的信息导入到细胞？重组质粒DNA转化微生物化学转化法电转化法基因枪转化法电转化法的特点适用微生物多效率高死亡率高化学转化法的特点适用微生物较少效率较高基因枪转化法的特点适用微生物较少效率较高革兰氏阳性菌的转化一般需要制备原生质体真菌的转化一般需要制备原生质体植物遗传转化方法和技术根癌农杆菌介导的植物转基因图10-1农杆菌侵染伤口的模式图基因枪介导法电转化法PEG转化法花粉管通道法动物遗传转化方法和技术原核显微注射法胚胎干细胞介导法病毒载体法1980年代初，ES细胞分离和体外培养成功奠定了基因重组/敲除的技术基础1985年首次证实了哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因重组/敲除的理论基础1987年，Thompssonetal首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型在随后的时间里基因敲除技术得到了进一步发展和完善基因重组/敲除的概念及简史基因敲除的原理②①基因突变RNAi③同源重组RNAi引起基因敲除的机制同源重组进行的基因敲除是通常意义上的基因敲除适用范围：适用的细胞既可以是原核细胞，也可以是真核细胞;原理(应用DNA同源重组原理)：通过外源载体和内源靶位点相同的核苷酸序列之间的同源重组,使外源DNA定点整合到靶细胞的特定的基因座上同源重组引起的基因敲除单交换双交换图1图2同源重组原理图示构建与靶基因同源(10～15kb)的载体外显子插有新霉素抗性基因（neor）作为正选择疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因作为负选择neor和HSV-tk作双重筛选存活的ES细胞将重组体导入ES细胞，体外培养显微注射回交得到X被敲除的动物表型分析同源重组引起的基因敲除—ES细胞技术路线图示ZFN技术原理锌指核酸酶（Zinc-fingernucleases,ZFN）是人工改造的限制性核酸内切酶，利用不同的锌指结构识别特异DNA序列，利用核酸酶切断靶DNA。•锌指结构中每一个α螺旋可以特异识别3-4个碱基；•人工设计识别特异DNA序列的α螺旋采用如上的通用序列，通过改变其中7个X来实现识别不同的三联体碱基，TGEK是多个螺旋间的连接序列；•构建成对人工锌指结构域和FokI融合蛋白（ZFN）可以在指定区域切断DNA双链。ZFN技术锌指核酸酶介导的定向染色体删除研究人员可以利用ZFN技术进行各种基因编辑，比如基因敲除。已建立有ZFN库，识别多种DNA序列，但还不能达到识别任意靶DNA的目的，其应用受到一定的限制。崭新的技术-TALEN经典的挑战–染色体DNA序列的人工编辑修改•（点）突变：Silent；Missense；Nonsense；Frameshift（基因敲除，Knockout）•片段删除•片段插入目的与用途：生物模型；表达工具；基因治疗崭新的技术解决经典的挑战靶向基因