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中药化学实用技术学习情景八中药中其他类型化学成分的提取分离技术学习目标1掌握中药中其他类型化学成分的提取分离技术。知识要求2掌握儿茶中鞣质类化学成分的提取分离原理及操作技术；熟悉青木香中有机酸类化学成分的提取分离原理及操作技术；了解丁南瓜子中南瓜子氨酸及决明子中蛋白质类化学成分提取分离原理及操作技术。能力要求3熟练进行儿茶中鞣质类化学成分及青木香中有机酸类化学成分的提取分离操作；能进行南瓜子中南瓜子氨酸及决明子中蛋白质类化学成分的提取分离操作。教学内容二有机酸类化学成分的提取分离技术三氨基酸类化学成分的提取分离技术四蛋白质和酶类化学成分的提取分离技术一鞣质类化学成分的提取分离技术鞣质类化学成分的提取分离知识儿茶中鞣质类化学成分的提取分离技术三二鞣质类成分的结构类型一鞣质类化学成分的提取分离技术鞣质定义鞣质又称单宁（tannin）或鞣酸（tanninacid），是一类复杂的多元酚类高分子化合物，能沉淀蛋白质。分布鞣质广泛存在于植物界，约70%以上的药材中含有鞣质类化合物，在裸子植物及双子叶植物的杨柳科、山毛榉科、蓼科、豆科、蔷薇科和茜草科中为多。生物活性鞣质具有收敛、止血作用。内服可用于治疗胃肠道出血、溃疡和水泻等症，外用于灼伤、创伤的创面，可使创伤表面渗出物中的蛋白质凝固，形成痂膜，保护创面，防止细菌感染。一、鞣质类成分的结构类型缩合鞣质此类鞣质一般不能水解，但经酸处理后可缩合成为不溶于水的高分子化合物鞣酐，又称鞣红。有多元醇与没食子酸酯化的产物。这类鞣质具有酯键或苷键结构，易被酸、碱、鞣酸或苦杏仁酶水解。根据水解后的产物又可分为没食子酸和鞣花酸鞣质两类。可水解鞣质复合鞣质是逆没食子鞣质部分与原花色素部分结合组成的，具有可水解鞣质和缩合鞣质的一切特征。（一）.可水解鞣质可水解鞣质分类没食子酸鞣质没食子酸鞣质水解后产生没食子酸和糖（或多元醇），如大黄和五倍子中的鞣质。逆没食子酸鞣质水解后能生成逆没食子酸和糖或同时有没食子酸或其他的酸生成，但有些逆没食子酸鞣质的原始结构中并无逆没食子酸的组成，其逆没食子酸是由鞣质水解所产生的黄没食子酸或六羟基联苯二甲酸失水转化而来。如诃子鞣质各种五倍子鞣质的结构诃子鞣质实例OOOOOOGGGGGZGXCOOHOHOHGGy%含量五没食子酰葡萄糖X+Y+Z=04六没食子酰葡萄糖X+Y+Z=112七没食子酰葡萄糖X+Y+Z=219八没食子酰葡萄糖X+Y+Z=325九没食子酰葡萄糖20十至十一没食子酰葡萄糖21OCOOHOHHOHOORCOOHR=-glc-C-glc（二）.缩合鞣质缩合鞣质在中药中分布较广，天然鞣质多数属于此类，如虎杖、四季青、儿茶、桂皮、麻黄等所含的鞣质均属缩合鞣质，但有些中药中所含的鞣质为可水解鞣质与缩合鞣质的混合物。缩合鞣质的结构比较复杂，一般认为它与羟基黄烷类，特别是羟基黄烷-3-醇和羟基黄烷-3，4-二醇有密切的关系，可以认为羟基黄烷类是缩合肉制的前体，羟基黄烷之间以碳-碳键缩合成鞣质，故不能水解。羟基黄烷类主要以儿茶素为代表，儿茶素不是鞣质，不具有鞣质的通性，当它们相互缩合成大分子多聚物后即具有鞣质的特性。如双儿茶素为二聚物，只有部分鞣质的性质，仍属于前体物，随着聚合度的增加，鞣质的性质越显著，真正的缩合鞣质为三、四及五聚合物等。（-）儿茶素的结构双儿茶素的结构实例OOHHOHOHOHOHHOOHHOHOHOHOHHHCOHOHOHOHOHHO课堂互动1.鞣质可以分为哪几类？分类依据是什么？2.去除鞣质的方法有哪些？为何要去除存在于多数中药中的鞣质类成分？二鞣质类化学成分的理化性质性味溶解性还原性鞣质多为无定形固体，有涩味和收敛性，能与蛋白质结合成不溶于水的化合物。如在鞣质的水溶液中加入明胶可产生混浊或沉淀。鞣质可溶于水和乙醇中，形成胶体溶液，也可溶于丙酮、醋酸乙酯、乙醚和乙醇的混合溶液，不溶于极性小的有机溶剂和无水乙醚、氯仿、苯、石油醚、二硫化碳、四氯化碳等。鞣质具有还原性，在空气中尤其在碱性条件下极易被氧化。鞣质的水溶液长时间放置或与稀酸共煮，因氧化、聚合作用可生成水不溶性沉淀，所以，一些中药针剂在灭菌贮藏过程中易析出沉淀。三鞣质类化学成分的的提取分离与检识鞣质类化学成分的提取分离与检识提取检识分离醋酸铅沉淀法三氯化铁反应和铁氰化钾反应生物碱及重金属盐反应明胶沉淀法生物碱沉淀法（一）提取因鞣质含有多个酚羟基使其具有较强极性及不稳定性，导致它易与金属离子生成缩合物而不易被提取出，因此一般选用玻璃或不锈钢的容器进行提取。总鞣质的提取可利用丙酮-水（5:5）～（7:3）作溶剂来提取可水解鞣质。用上述溶剂于室温冷浸或渗漉提取中药粗粉，提取液浓缩至一定程度，依次用乙醚或氯仿、醋酸乙酯和正丁醇萃取，乙醚或氯仿可去除亲脂性杂质及色素等，醋酸乙酯和正丁醇部位即含鞣质粗品。（二）分离PiaionHP-20和MCl-gelCHP-20经常被用于一些鞣质异构体的分离，均用不同比例的甲醇-水和乙醇-丙酮作为洗脱剂。常用SephadexL-H-20分离水解鞣质，主要用于不同聚合度鞣质的分离。鞣质的去除方法凝胶柱色谱法大孔吸附树脂色谱鞣质除在中药五倍子、地榆中含量较高为有效成分外，多数情形下为无效成分，因此在提取分离过程中须将它除去。鞣质的去除方法利用蛋白质与鞣质在水溶液中形成鞣酸蛋白的原理而除去鞣质。样品水溶液加4%明胶水溶液，至沉淀完全，过滤，滤液减压浓缩至小体积，加3~5倍量乙醇，使过量明胶沉淀，滤去沉淀。中性和碱式醋酸铅在水或稀醇溶液中能与许多物质生成难溶的铅盐或络盐。试液中加入饱和醋酸铅水溶液可使鞣质产生沉淀，从而除去鞣质。操作中要注意脱铅处理。（方法有：硫化氢脱铅法、硫酸钠脱铅法及离子交换树脂法等）生物碱沉淀法醋酸铅沉淀法明胶沉淀法样品水溶液加入生物碱（如1.5%吡啶）水溶液至沉淀完全，过滤，滤液用氯仿振摇，除去过量的生物碱即得（注意水溶液中其他成分可否被氯仿提出）。课堂互动用前述知识说明儿茶中各种化学成分的特点和性质，并分析生产工艺中如何提取各种不同的鞣质类成分。知识链接（凝胶色谱）以多孔凝胶作为固定相的柱色谱形式称为凝胶色谱。（一）凝胶色谱原理凝胶色谱原理是分子筛原理。因凝胶颗粒具三维的网状结构，在水中可膨胀并有许多一定大小的网眼。当溶液通过凝胶颗粒时，溶液中分子直径小于网眼的成分可进入凝胶内部，而分子直径大于网眼的成分则被排阻在凝胶颗粒之外，按分子由大到小的顺序流出。因此凝胶色谱又称为分子排组色谱、凝胶过滤色谱、凝胶渗透色谱等。（二）基本构成要素（三）类型凝胶色谱的基本构成要素有固定相、流动相以及被分离成分的溶液。凝胶色谱一般按选用的流动相不同分为两类。以水溶液为流动相的叫凝胶过滤色谱(GFC)；以有机溶剂为流动相的叫凝胶渗透色谱(GPC)。（四）操作技术1．凝胶的预处理2．装柱3．上样4．洗脱5．收集凝胶色谱基本构成要素固定相（1）种类固定相是多孔凝胶（G）。主要有葡聚糖凝胶（sephadexG）和羟丙基葡聚糖凝胶(sephadexLH-20)。后者为G-25经羟基化处理得到的产物。最常用的是葡聚糖凝胶。（2）葡聚糖凝胶的结构葡聚糖凝胶也称交联葡聚糖凝胶，是由葡聚糖和甘油基通过醚桥相互交联而成的多孔性网状结构，其结构式如下：OOOOOOCH2OHOHOHOCH2OOHOHOOCH2CH2CHOHCH2OOHOHOHOOHOHCH2OOCH2OHOHOHOCH2OHOOHCH2CHOHCH2OO凝胶色谱基本构成要素固定相（3）葡聚糖凝胶的性质葡聚糖分子内含有大量羟基而具有极性，在水中即膨胀成凝胶粒子，是一种水不溶性的白色球状颗粒，由于醚键的不活泼性，因而具有较高的稳定性。不溶于水和盐溶液，在碱性和弱酸性溶液中性质稳定，但在酸性溶液中高温加热能促使糖甙键水解。和氧化剂接触会分解，长期不用宜加防腐剂。（4）葡聚糖凝胶的型号1）型号：凝胶的商品型号用吸水量来表示。如G-25型号中G代表葡聚糖凝胶，后面的阿拉伯数值表示该型号的干凝胶1g所吸收水量的10倍值。即G-25型号每克干凝胶的吸水量为2.5g。商品型号有G-10、G-15、G-25、G-50、G-75、G-100、G-200等。2）不同型号的性能及应用：型号数字越大，吸水量越大，凝胶体积膨胀越大，孔隙也越大，可用于大分子物质的分离；反之，用于小分子物质的分离。G型凝胶用于流动相为水的色谱分离；另外，LH型凝胶应用范围更广，极性、亲水性和亲脂性流动相中均可应用。凝胶色谱基本构成要素流动相（1）基本要求流动相必须是能够溶解试剂的溶剂；不能破坏凝胶的稳定性；能润湿凝胶使其膨胀；粘度要低，能保持一定的流动性。（2）种类1）极性溶剂和亲水性溶剂：水和各种水溶液。2）亲脂性溶剂：各种亲脂性有机溶剂。如氯仿、四氢呋喃、甲苯等。（3）选择原则分离水溶性样品选择极性溶剂和亲水性溶剂；分离脂溶性成分选择亲脂性溶剂。凝胶色谱的操作技术凝胶的预处理将干凝胶用选好的流动相（溶剂）充分浸泡膨胀后备用。一般选择直径为2.5cm的柱子。凝胶装入柱中后，放出溶剂，在用溶剂不断流洗柱子，使凝胶沉集、柱床稳定。并始终保持一定的液面。把需要分离的成分溶于选好的溶剂中，上样前为防止破坏柱床表面，要在柱床表面放一张滤纸。上样方法同一般柱色谱。洗脱剂和浸泡凝胶所用的溶剂相同。分段收集，定性检查，合并同一组分，再行精制。装柱上样洗脱收集鞣质类的检识生物碱及重金属盐反应三氯化铁反应和铁氰化钾反应由于鞣质结构中含有大量酚羟基，因此在鞣质的水溶液中加入三氯化铁能产生绿色、蓝色或沉淀；鞣质与铁氰化钾的氨溶液反应产生深红色并很快变成棕色。鞣质可与生物碱及重金属盐作用生成不溶于水的沉淀。如与醋酸铅、醋酸铜、浓重铬酸钾。还可与碱土金属的氢氧化物如氢氧化钙溶液生成沉淀。（三）检识任务一儿茶中鞣质类化学成分的提取分离技术学习目标一二三儿茶中儿茶素的提取分离技术必备知识四课堂互动学习目标1掌握儿茶中鞣质类化学成分的提取分离原理及操作技术。知识要求2掌握儿茶中鞣质类化合物的提取、分离及鉴定技术。熟悉儿茶中鞣质类化合物的结构及性质。了解儿茶中鞣质类化合物的存在及生物活性。能力要求3熟练进行儿茶中鞣质类化合物的提取、分离及鉴定操作。学会儿茶中鞣质类化合物的色谱鉴定技术。一学习目标二儿茶中鞣质类化学成分的提取分离技术本品为豆科植物儿茶(Acaciacatechu(L.F.)Willd)的去皮枝、干的干燥煎膏。冬季采收枝、干，除去外皮，砍成大块，加水煎煮，浓缩，干燥。在我国主要分布在云南、广西等地。具有收湿生肌敛疮等作用。（一）设备、仪器及药品渗漉筒、普通漏斗、锥形瓶、减压浓缩装置、玻璃棒、纱布、新鲜儿茶心材粉末、丙酮、醋酸乙酯（二）儿茶中（-）表儿茶素与儿茶素的提取与分离流程1.儿茶中（-）表儿茶素的提取与分离儿茶心材粗粉丙酮渗漉液重复渗漉两次残渣减压回收丙酮丙酮加乙酸乙酯,过滤结晶乙酸乙酯溶液(-)表儿茶素儿茶心材粗粉丙酮渗漉液重复渗漉两次残渣减压回收丙酮丙酮加乙酸乙酯,过滤结晶乙酸乙酯溶液(-)表儿茶素2.儿茶素的提取与分离中药儿茶加入5倍量的85%乙醇，水浴20min过滤，残渣用2~3倍量的85%乙醇重提过滤，合并滤液，减压浓缩至无醇味浓缩液热溶于10倍量的水中，冰箱过夜，过滤滤液加10倍量的4%明胶溶液，水浴加热搅拌使鞣质沉淀凝聚后过滤，滤液减压浓缩浓缩液用1倍量的氯仿萃取，多次用氯仿萃取至氯仿层无色为止氯仿层萃取液用1倍量的乙酸乙酯萃取数次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩至小体积儿茶素提取物（二）儿茶中主要有效成分的提取分离（一）儿茶中主要化学成分的结构、理化性质三必备知识（一）儿茶中主要化学成分的结构、理化性质儿茶中主要含有酚酸性成分。包括儿茶素、（-）表儿茶素、儿茶鞣酸、对苯二甲酸甲酯等。此外，还含有较多的多聚糖，如由半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖及葡萄糖醛酸组成的二聚糖、三聚糖、六聚糖等。（-）表儿茶素类白色粉末，熔点242℃，溶于水（易溶于热水）、甲醇、乙醇、冰醋酸等，不溶于苯、氯仿、石油醚。（+）儿茶素（-）儿茶素类白色粉末，溶于热水、甲醇、乙醇、冰醋酸等，不溶于苯、氯仿、石